دانشگاه آزاد اسلامي
واحد دامغان
دانشکده علوم پايه

پايان‌نامه کارشناسي ارشد رشته ژنتيک

عنوان
بررسي افزايش ميزان ميکرو RNAي21 (miR-21) در سرم بيماران مبتلا به آدنوکارسينوماي معده

استاد راهنما
دکتر غلام بساطي

استاد مشاور
دکتر ناهيد مسعوديان

نگارنده
پگاه پرتو

پاييز 1393
فهرست مطالب

عنوانصفحه
فرضيه‌ها 9
چکيده 11
فصل اول: کليات تحقيق
1-1- مقدمه 12
1-1- آشنايي با سرطان 14
1-2- سرطان معده 15
1-2-1- نشانه ها و علائم سرطان معده 15
1-2-2- دلايل ابتلا به سرطان معده 17
1-2-3- توزيع جغرافيايي سرطان معده در جهان و ايران19
1-2-4- مرگ و مير 21
1-2-5- تعيين مراحل بيماري 22
1-2-6- سير باليني بيماري 24
1-2-7- ارتباط سرطان معده و ميکرو RNA 25
فصل دوم: مروري بر تحقيقات انجام شده 31
فصل سوم: مواد و روش‌ها
3-1-1 مقدمهReal Time PCR 34
3-1-2 انواع تکنيک هاي Real-Time PCR 35
3-1-3 آناليزهاي کمي در Real time PCR 36
3-1-4 مزاياي Sybr Green Real Time PCR 36
3-1-5 منحني ذوب37
3-1-6 اصطلاحات موجود در Real time PCR38
3-2 روش کار38
3-2-1 مرحله اول: انتخاب بيمار39
3-2-2مرحله دوم: تهيه سرم از بيمار39
3-2-3 مرحله سوم: استخراج RNA از سرم39
3-2-4 آماده سازي محلول هاي لازم براي کيت استخراج RNA از سرم40
3-2-5 ارزيابي بازده و کيفيت RNA ي جدا شده41
3-2-6 واکنش رونويسي معکوس43
3-2-7 انجام واکنش Real Time PCR44
3-2-8 تعيين سيگنال پايه54
3-2-8 تعيين سيکل آستانه54
3-2-8 آناليز منحني ذوب46
3-3-1 محاسبه ميزان miRNA-21 نمونه هاي تحت مطالعه47
3-3-2 آناليز آماري داده ها48
فصل چهارم: نتايج
4-1 خصوصيات بيماران و ويژگي‌هاي پاتولوژيکي آنها49
4-2 وضعيت بيان مارکر miRNA-21 و ارتباط آن با فاکتورهاي پاتولوژيکي50
فصل پنجم: بحث و نتيجه‌گيري
5-1- بحث 55
5-2- نتيجه‌گيري 61
منابع 62
چکيده انگليسي 68
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
شکل1-1لايه هاي ديواره معده16
شکل 1-2 ميزان پراکندگي سرطان معده در ايران21
شکل 1-3 پردازش ميکروRNA27
شکل3-1 باند در ژ الکتروفورز42
شکل3-2 تنظيم دمائي Real-Time PCR 45
شکل4-1 مقادير miR-21 در سرم بيماران و افراد کنترل51
شکل4-2 مقادير miR-21 در سرم بيماران52
شکل4-3 منحني راک54
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار 3-1 نمودار شدت فلوئورسانس46

فهرست جدول‌ها
عنوان صفحه
جدول4-1خصوصيات باليني و دموگرافيک افراد تحت مطالعه50
جدول 4-2 آناليز رگرسيون خطي که براي ديگر متغييرهاي زمينه اي کنترل شده53
فرضيه‌ها:

با توجه به آنکه miR-21 توسط بافت توموري سرطان معده بيشتر از بافت سالم توليد مي شود، لذا انتظار مي رود که ميزان سرمي آن نيز در بيماران نسبت به افراد کنترل بطور قابل توجهي بالاتر برود و نيز اين افزايش با مرحله بندي(staging) تومور آدنوکارسينوماي معده در بيماران ارتباط داشته باشد.
-آيا ميزان miR-21ي سرم نشانگر قابل اعتماد براي تشخيص زودهنگام آدنوکارسينوماي معده در مقايسه با افراد کنترل است؟
-آيا هرچه ميزان غلظت miR-21 در سرم بيشتر باشد مرحله بندي (staging) تومور در بيماران مبتلا به آدنوکارسينوماي معده پيشرفته تر است؟
-آيا بيان بالاي miR-21 با پيشرفت سرطان ارتباط مستقيم دارد؟
هدف كلي:
ارتباط ميزان miR-21 در سرم با پارامترهاي تشخيصي و کلينيکوپاتولوژيکي (مانند مرحله بندي تومور) در بيماران مبتلا به آدنوکارسينوماي معده
اهداف اختصاصي :
– تعيين ميزان miR-21 در سرم افراد مبتلا به آدنوکارسينوماي معده
– تعيين ميزان miR-21 در سرم افراد کنترل
– ارتباط بين ميزان miR-21 سرم و مرحله بندي تومور در بيماران
-تعيين مرحله بندي هاي (staging هاي I، II، III و IV) تومور افراد مبتلا به آدنوکارسينوماي معده
اهداف كاربردي:
ارزيابي ارزش تشخيصي ميزان miR-21 در سرم به عنوان بيومارکري غير تهاجمي در تشخيص زود هنگام (stage هاي اوليه تومور) آدنوکارسينوماي معده و نيز افتراق دادن بيماران از افراد کنترل
چکيده
مقدمه: ميکروRNA ها گروه جديدي از RNA هاي تنظيمي هستند که حدود 22 نوکلئوتيد طول دارند. همچنين ميکروRNA ها در بسياري از سرطان هاي انساني نقش دارند، و ظاهرا هم به عنوان انکوژن و هم به عنوان سرکوبگر تومور عمل مي کنند. در اين بررسي ارتباط بين ميزان mir-21 در سرم افراد بيمار و سالم و ارتباط بيان بالاي اين ميکروRNA با مرحله بندي تومور و پيشرفت سرطان براي اولين بار در ايران بر روي سرطان آدنوکارسينوماي معده انجام گرفت.
روش کار: در اين مطالعه بر روي 40 بيمار مبتلا به سرطان آدنوکارسينوماي معده و 40 بيمار که بعلت ناراحتي گوارشي مراجعه کرده اند ولي بعد از تشخيص سالم و يا غير سرطاني بوده اند نيز بعنوان گروه شاهد انتخاب گرديدند ميزان miR-21 سرم آنها با استفاده از تکنيک Real-Time PCR اندازه گيري گرديد وارتباط بين بيان اين ميکرو RNA با مرحله بندي تومور و پيشرفت سرطان مورد ارزيابي قرار گرفت.
نتايج: افزايش بيان mir-21 در نمونه‌هاي سرمي، ميزان miR-21 سرم در بيماران حدود 5/3 برابر افراد کنترل بود ( 0001/0 p< ) ، ميزان miR-21 سرم در بيماران ارتباط معني داري با مرحله بندي تومور نشان داد (01/0p< ،56/0 =?)، نشانگر ارتباط معني‌دار و مستقيم mir-21 با افزايش اندازه تومور ميباشد که بيانگر اهميت اين ميکروRNA در پيشرفت سرطان معده است.
نتيجه‌گيري: با توجه به نقش mir-21 در پيشرفت سرطان معده و سرطان‌هاي مختلف و با توجه به ارتباط آن با فاکتورهاي کلينيکوپاتولوژيکي، مي‌توان آن را به عنوان مارکر تشخيصي جديد و به عنوان يک روش غير تهاجمي در تشخيص زود هنگام بيماران سرطان آدنوکارسينوماي معده معرفي کرد. در اين بررسي، mir-21 نقش انکوژني دارد که با سنجش ميزان آن در سرم بيماران مي‌توان پيشرفت سرطان معده را بررسي کرد.
واژه هاي کليدي: آدنوکارسينوماي معده، ميکروRNA، mir-21

مقدمه:

سرطان نتيجه خروج سلول ها از مسيرهاى درست تنظيمى، تكثيري، و تمايزي است. خودكارآمدي در سيگنال هاى رشد، غيرحساس شدن به سيگنال هاى مهاركننده رشد، اجتناب از مرگ سلولى برنامه ريزى شده، پتانسيل نامحدود تكثير، حفظ رگ زايى و تهاجم بافتى و متاستاز منجر به بدخيم شدن سرطان مي شوند. برهمکنش ميکرو RNA ها با ژن هاي هدف، نقش آنها را در رشد، مرگ برنامه ريزي شده، تمايز و تکثير سلولي مشخص کرده و عملکرد مستقيم ميکرو RNA را در سرطان تاييد ميکند. مي توان از بيان ميکرو RNA هاي غالب براي طبقه بندي سرطانها در گروههايي با ويژگى هاى متفاوت مثل نوع سلول و سبب شناسى استفاده كرد. استفاده از ميکرو RNA براي طبقه بندي تومور به مراتب مناسب تر از mRNA مى باشد،اين امر به علت جفت شدگي ناقص بين ميكرو RNA و mRNA هاي هدف است، از اين رو ريز سنج هاي ميكرو RNA ميتوانند بيان چند صد ژن و در نتيجه مسير هاي متعدد را در يك نمونه شناسايي كنند، در حالي كه تنها به مقادير كمي از RNA کل نياز دارند. ساختار ميکرو RNA ها و نحوه عملکرد آنها نشان ميدهد که بسياري از ميکرو RNA ها در نمونه هاي سرطاني به صورت غير طبيعي بيان ميشوند. علاوه بر اين، تفاوت هاى عملكردى بين انواع تومورها و مراحل مختلف سرطان با بيان ميكروRNA ها مرتبط است. بيان ميکروRNA با ويژگى هاى بالينى و زيستي تومور از قبيل نوع بافت، تمايز، تهاجم و پاسخ به درمان مرتبط است. استفاده از ميکرو RNA ها به عنوان نشان گرهاى تشخيصى از طريق بررسى سرم يا پلاسماى انسانى امكان پذير است، از اين رو مى توان ميكروRNA هاي سرطاني و سلول هاي توموري موجود در سرم يا پلاسما را بدون هيچ گونه روش تهاجمي شناسايى كرد. به استثناى لوسمى ها كه سلول هاى بدخيم به آسانى در دسترس هستند. براي سرطان هاى جامد، نمونه برداري بافت از طريق بيوپسى يا جراحي انجام مي گيرد، و چون معمولاً جراحى زمانى صورت مى گيرد كه سرطان به ميزان قابل توجهي پيشرفت نموده، تشخيص آن چندان مفيد نميباشد. در اين موارد استفاده از ميکرو RNA ها يي که با فنوتيپ هاى بدخيم ارتباط تنگاتنگ دارند به عنوان نشان گرهاى تشخيصى جهت تشخيص بيماري در مراحل آغازين آن بسيار کمک کننده است. با در نظر گرفتن اين واقعيت كه اغلب روش هاى رايج براى غربال گرى سرطان در مراحل اوليه قادر به تشخيص بيمارى نمى باشند، شناسايى ميکرو RNA هاي توموري که طي پيشرفت تدريجي بيماري در جريان خون منتشر ميشوند، روش کليدي در تشخيص به موقع سرطان محسوب ميشود.

فصل اول
کليات تحقيق

1-1 آشنايي با سرطان
بدن انسان از تريليونها سلول زنده ساخته شده که اين سلولها در يک بدن طبيعي رشد ميکنند، تقسيم ميشوند تا سلولهاي جديد را بوجود بياورند و در نهايت به يک شکل منظم ميميرند. در طي سالهاي اوليه زندگي يک فرد سلولها سريع تر تقسيم ميشوند تا به فرد اجازه رشد بدهند، بعد از اينکه فرد بالغ شد و به بلوغ رسيد، اکثر سلولها فقط براي جايگزين شدن با سلولهاي فرسوده و يا سلولهاي در حال مرگ ويا بازسازي جراحات تقسيم ميشوند( et al., 2011 Avital). سرطان زماني آغاز ميشود که سلولها در يک قسمت از بدن شروع به رشد خارج از کنترل کنند، انواع مختلفي از سرطانها وجود دارد اما ويژگي مشترک در تمامي سرطانها رشد غير طبيعي و خارج از کنترل سلولها ميباشد رشد سلولهاي سرطاني متفاوت از رشد سلولهاي عادي است بطوريکه سلولهاي سرطاني به جاي داشتن يک مرگ طبيعي به رشد خود در شکل و فرم جديدي در غالب سلولهاي غير عادي و ناهنجار ادامه ميدهند. يکي از توانايي هاي منحصر به فرد سلولهاي سرطاني که آنها را از سلولهاي عادي متمايز ميسازد توانايي حمله به ديگر بافتهاي بدن ميباشد(Hanahan D et al., 2011). رشد خارج از کنترل، تهاجم به بافتهاي ديگر يک سلول را به سلولي سرطاني تبديل ميکند. سلولها به دليل صدمه به DNA سرطاني ميشوند، وظيفه DNA در سلولها مديريت تمامي اعمال آنهاست. در يک سلول طبيعي وقتي DNA دچار آسيب ميشود سلول ميکوشد که آسيب را ترميم کند در صورت عدم ترميم سلول ميميرد. در سلولهاي سرطاني DNA آسيب ديده ترميم نميشود و سلول نميميرد، سلول سرطاني با همان DNA آسيب ديده شروع به تقسيم ميکند و به جاي مردن توده اي از سلول هايي را بوجود مي آورد که همان آسيب DNA را دارند. در اغلب موارد سلولهاي سرطاني که تومور را تشکيل ميدهند به ساير نقاط بدن سفر ميکنند و در بافتهاي طبيعي شروع به رشد و تکثير تومورهاي جديد ميکنند، به اين روند متاستاز ميگويند. متاستاز زماني اتفاق مي افتد که سلولهاي سرطاني به جريان خون، لنف يا عروق بدن راه پيدا کنند(et al., 2014 Atlanta Ga ).
يکي از عامل هاي مهم در درمان سرطان فهميدن اين موضوع است که سرطان از کجا شروع شده و منشا آن کجاست، به عنوان مثال سرطان سينه اي که به کبد گسترش يافته است همان سرطان سينه است، يا سرطان پروستاتي که به استخوان انتشار يافته کماکان سرطان پروستات ناميده ميشود. انواع مختلف سرطان مي تواند بسيار متفاوت رفتار کند به عنوان مثال سرطان هاي سينه و ريه بيمار ي هاي بسيار متفاوتي هستند به روش هاي مختلف رشد مي کنند و پاسخ به درمان آنها متفاوت است به همين دليل هر سرطان درمان خاص خود را دارد. همه ي تومورها سرطاني نيستند به تومورهاي غير سرطاني خوش خيم ميگويند. تومورهاي خوش خيم نيز ميتوانند باعث بروز مشکلاتي شوند آنها ميتوانند رشد کنند، بزرگ شوند وبه ساير بافت ها و اندام هاي ديگر فشار بياورند آنها همچنين قدرت متاستاز ندارند و ازين جهت تهديدي براي زندگي نيستند(Benusiglio PR et al., 2008).
1-2- سرطان معده
براي اينکه درک بهتري از هر سرطان داشته باشيم در ابتدا بايد ساختار طبيعي و عملکرد آن بافت را بدانيم پس در ابتدا به تشريح ساختار معده ميپردازيم.
معده اندامي است کيسه مانند که مواد غذايي را نگه ميدارد و آن را با ترشح شيره معده هضم ميکند. معده از پنج بخش تشکيل شده است: کارديا(cardia) ،فندوس(fundus) ،بادي(body) ،آنتروم(antrum) ،پيلروس(pylorus) . سه قسمت ابتدايي معده بنام معده پروگزيمال خوانده ميشوند، و دو قسمت انتهايي نيز معده ديستال ناميده ميشوند. ديواره معده داراي پنج لايه ميباشد، دروني ترين لايه مخاط ميباشد در اين لايه اسيد معده و آنزيم هاي گوارشي ساخته ميشود و بيشتر سرطان هاي معده از اين لايه شروع ميشود. دومين لايه که بعد از لايه ي مخاط قرار گرفته است زير مخاط(sub mucosa)، ناميده ميشود، سومين لايه که لايه ي ضخيم عضلاني است، کار آن مخلوط کردن محتويات معده ميباشد بنام آستر عضلاني( muscularis propria)، خوانده ميشود.
شکل1-1 : لايه هاي تشکيل دهنده ديواره معده
دو لايه ي خارجي تر براي پوشش معده بکار ميروند(Bae J et al., 2008).
شناخت لايه هاي معده از آن جهت حائز اهميت است که در تعيين کردن مرحله (stage) سرطان بسيار مهم ميباشد، سرطان از لايه مخاطي شروع ميشود و به لايه هاي عميق تر نفوذ ميکند هرچه به لايه هاي زيرين بيشتر نفوذ کرده باشد مراحل بيماري پيشرفته تر ميباشد. سرطان معده به آهستگي و طي چندين سال توسعه پيدا ميکند، البته قبل از توسعه سرطان يک سري تغييرات در لايه ي مخاط رخ ميدهد که اين تغييرات به ندرت باعث بروز علائمي ميشود که قابل تشخيص باشد. سرطان معده بيماري ايست که به صورت نهفته و آهسته پيش ميرود، اينکه سرطان تا چه مرحله اي پيش رفته باشد و به کدام لايه ها نفوذ کرده باشد درمان را تحت تاثير زيادي قرار ميدهد. سرطان معده ميتواند به ديواره معده و از آنجا به ارگانهاي مجاور حمله کند و متاستاز بدهد، همچنين ميتواند به عروق لنفاوي گسترش يافته و به غدد لنفاوي وارد شود(Capelle LG et al., 2008).
1-2-1 نشانه ها و علائم سرطان معده
-خستگي
-احساس نفخ پس از غذا خوردن
-احساس سيري پس از کمي خوردن غذا
-سوزش شديد و مداوم معده
-سوء حاضمه شديد و درمان نشدني
-حالت تهوع مداوم و بي دليل
-درد معده
-کاهش وزن بي دليل
-وجود خون در مدفوع(خون سياه و قيري رنگدر مدفوع)
-استفراغ خوني
-خستگي و کم خوني
1-2-2- دلايل ابتلا به سرطان معده
دليل قطعي ابتلا به سرطان معده هنوز شناخته نشده است، با اين حال عواملي که در ادامه بيان مي کنيم خطر ابتلا به اين بيماري را افزايش مي دهد.
-جنسيت: مردان دو برابر بيشتر از زنان در خطر ابتلا به اين بيماري هستند.
-نژاد: نژادهاي آفريقايي و آسيايي در خطر بيشتري هستند.
-ژنتيک: مشکلات ژنتيکي و يا سندرم هاي ارثي سرطان خطر ابتلا به سرطان معده را افزايش ميدهد.
-ناحيه جغرافيايي: سرطان معده در ژاپن، شوروي سابق، آفريقاي مرکزي شايع تر است.
-گروه خوني: افرادي که داراي گروه خوني A مثبت هستند در معرض خطر بيشتري قرار دارند.
-افزايش سن: سرطان معده در سنين 65 تا 75 سال شايع تر مي باشد.
-سابقه خانوادگي: در صورت ابتلاي يکي از افراد درجه يک خانواده به سرطان معده خطر ابتلاي ديگران هم 2يا3 برابر مي شود.
-سبک زندگي: سيگار کشيدن، مصرف الکل و رژيم غذايي کم ميوه و سبزي ويا غذاهاي شور، دودي و يا حاوي مواد نگهدارنده نيترات دار خطر ابتلا به سرطان معده را افزايش مي دهد.
-هليکوباکتر پيلوري: آلوده شدن به باکتري H. pylori که لايه ي پوشاننده معده را آلوده کرده و باعث التهاب و زخم معده مزمن مي شود، خطر ابتلا به اين بيماري را افزايش مي دهد.
-بيماري هاي خاص: از جمله ورم معده مزمن، پوليپ معده، متاپلازي روده اي و يا جراحي معده خطر ابتلا به اين سرطان را افزايش مي دهد.
همانطور که ذکر شد اين سرطان در افرادي با گروه خوني A شايع تر است(Howlader N et al., 2013). پسماندهاي سلولهاي جنيني در مري و يک سوم فوقاني معده عاملي براي ابتلا به سرطان معده است. بقاياي سلول هاي جنيني قابليت سرطاني شدن را دارند که با بررسي ها و تست هاي تشخيصي معمول، راديوگرافي و سي تي اسکن قابل شناسايي نيستند. علائم و و نشانه هاي اوليه سرطان معده گول زننده ومشابه ناراحتيهاي گوارشي است به طوريکه افراد سعي دارند با پرهيز غذايي و درمان خودسرانه بهبود پيدا کنند. کاهش وزن و بي اشتهايي علائم مهمي در تشخيص سرطان معده است. در مراحل اوليه ناراحتي هاي گوارشي چون تهوع، بي اشتهايي، کاهش وزن، درد ملايم و متناوب و در مراحل پيشرفته وجود خون در مدفوع و مدفوع سياه رنگ(ملنا) و در مراحل پيشرفته تر استفراغ خوني بروز ميکند. وجود هليکوباکتر پيلوري و استعداد ابتلاء فرد به سرطان معده از فرضيات موجود در دنياي پزشکي است. حال آنکه افزايش اسيد معده، استعمال دخانيات، مصرف غذاهاي نمک سود شده و دودي، افزايش مصرف غذاهاي سرخ کردني همگي از عوامل پر خطر براي ابتلاء به سرطان معده هستند. آندوسکوپي و راديوگرافي از راههاي تشخيص سرطان معده ميباشد. در زخم هاي معده احتمال سرطاني شدن وجود دارد از اين رو چنانچه زخم معده اي پس از 3 ماه دارو درماني به درمان پاسخ ندهد اندوکاسيوني براي جراحي معده است(Gunderson LL et al., 2008).
1-2-3- توزيع جغرافيايي سرطان مري در جهان و ايران
برآورد انجمن سرطان آمريکا براي سرطان معده در ايالات متحده در سال 2014 به قرار زير است: در 22220 مورد سرطان معده تشخيص داده شده 13130 مورد در مردان و 8490 مورد در زنان گزارش شده است، که هر ساله 10990 نفر بر اثر اين بيماري ميميرند که از اين تعداد 6720 نفر مرد و 4270 نفر زن ميباشند. اين بيماري بيشتر در افراد مسن ديده ميشود متوسط سن افراد مبتلا به اين بيماري 65 سال است(et al., 2014 Atlanta Ga ). سرطان معده در ايران در رتبه نخست شايع ترين سرطان براي مردان و رتبه سوم در زنان است. سرطان معده از شايع ترين و کشنده ترين انواع سرطان است که هر سال ده هزار نفر در ايران به اين بيماري مبتلا مي شوند به گفته وزارت بهداشت، کشور ما بيشترين بيماري سرطان معده را در جهان دارد و مهمترين دليل بالا بودن ميزان مرگ و ميرهاي سرطان معده، اين است که اغلب دير تشخيص داده ميشود(biglarian et al., 1386). در دنيا سرطان معده دومين عامل مرگ و مير بعد از سرطان ريه مي باشد. در حقيقت سرطان معده حدود 10? از کل سرطانها را شامل ميشود .به علت افزايش سن جمعيتها و افزايش ميزان بروز سرطان معده قربانيان اين سرطان در دنيا حدود 800000-900000 در هر سال بين سالهاي 1985 تا 1990 بوده است (cappas et al., 2002) . ميزان بروز سرطان معده در سطح بين المللي بطور تقريبي در کشور آمريکا در ميان سفيد پوستان با بروز استاندارد سني 7.5 در هر 100000 شخص- سال در مردان و 3.1 در هر 100000 شخص- سال در زنان مي باشد. بالاترين ميزان سرطان معده در ژاپن مي باشد که در اين کشور براي سرطان معده غربالگري انجام مي شود. در ژاپن ميزان بروز استاندارد شده سرطان معده بيش از 65 در هر 100000 در مردان و بيش از 25 در 1000000نفر در زنان گزارش شده است(Fukase K et al., 2008). هنگاميکه اشخاص جمعيت هاي مختلف با خطرهاي مختلف سرطان معده به کشور هاي ديگري سفر ميکنند . الگوي خطر آنها معمولا تغيير نميکند و يا اندکي تغير مي کند با اينحال در نسل دوم مهاجرين ميزان بروز کمتر از نسل اول و از مردم کشور اجدادي شان مي باشد. اين يافته ها نقش عوامل محيطي در زمان کودکي را مطرح مي کند(Hundahl SA et al.,2008). در آمريکا در سال 1930 سرطان معده به عنوان علت مرگ با اهميتي به شمار مي رفته و در سال 1995 هفتمين علت مرگ ومير و رتبه سيزدهم بروز سرطان هاست و در طول زمان کاهش بروز بصورت خطي مشاهده شده است. عوامل خطرهاي مرتبط با سرطان معده شامل : مصرف سيگار، رژيم غذايي، زخم معده و بخصوص عفونت هليکوباکتر پيلوري مي باشد. عفونت هليکو باکتر پيلوري به عنوان عامل خطر اصلي در مطالعات سرطان معده مورد بحت بوده است .اين ميکرو ارگانيسم به عنوان عامل سرطانزاي انساني طبقه بندي شده است. شواهد موجود دال بر ارتباط توزيع جغرافيايي و دموگرافيک عفونت هليکو باکتر پيلوري و بروز و مرگ و مير سرطان معده مي باشد. در مناطقي که ميزان اين عفونت بالاست بروز سرطان معده نيز بالا گزارش شده است(Fuchs CS et al., 2014). همچنين با بهبود وضعيت بهداشتي با کاهش شيوع اين عفونت بروز سرطان معده کاهش يافته است. لذا اين همبستگي ها نقش عفونت هليکو باکتر پيلوري و عوامل محيطي را در رابطه با سرطان معده تقويت نموده است. لذا برخورد با اين عفونت به عنوان هدف اوليه در استراتژيهاي پيشگيري مطرح شده است و داشتن دانش عميق در رابطه با عوامل موثر تغيير دهنده در شرايط ميکرو ارگانيسم هاي ميزبان يا محيط اهميت بسياري دارد. ارتباط بسيار زيادي بين زخم پپتيک و عفونت هليکو باکتر پيلوري وجود دارد. حدودا 100 درصد زخمهاي دوازدهه و 85 الي 90 درصد زخمهاي معده به عفونت هليکو باکتر پيلوري نسبت داده شده اند. لذا سرطان معده و زخم پپتيک از نظر علل به هم مشترک مي باشند ( Hohenberger P et al., 2007 ). سرطان معده بيشترين شيوع را درميان مردان ايراني دارد. بالاترين ميزان اين عفونت بخصوص در استان اردبيل گزارش شده است . همچنيني ميزان عفونت هليکوباکتر در اين استان بسيار بالا مي باشد(Hajiani E et al., 2006). با اين که سرطان معده به عنوان سرطان شايع مردان در کشور مطرح است ، مطالعه جامعي در مورد عوامل خطر و توزيع جغرافيايي اين بيماري در ايران صورت نگرفته است.

شکل1-2 : برآورد بروز سرطان معده در استان هاي کشور
1-2-4- مرگ و مير
علي‌رغم پيشرفت‌هاي تکنيکي در جراحي و راديوتراپي، چندان پيشرفتي در بقاي بيماران مبتلا به سرطان معده در طول 10 تا 20 سال گذشته حاصل نشده است. بطور کلي ميزان مرگ و مير ناشي از سرطان 15 در هر 100000 نفر مي باشد که در مجموع 23 درصد موارد مرگ ناشي از سرطان مي باشد. بيشترين ميزان مرگ و مير در استان کردستان و سپس در آذربايجان غربي گزارش شد. همچنين کمترين ميزان در استانهاي هرمزگان، سيستان و بلوچستان، و بوشهر مشاهده شد.
ميزان مرگ و مير ناشي از سرطان معده در روستاها دو برابر شهرها و در مردها دو برابر زنها مي باشد. ميزان مرگ و مير ناشي از سرطان معده در مردان روستايي که در استان کردستان به 45 در هر 100 هزار نفر مي رسد، در حاليکه در شهر نشينان همين استان ميزان آن 20 در هر 100 هزار نفر تخمين زده شد.
1-2-5- تعيين مرحله بيماري
تشخيص مرحله بيماري يکي از مهمترين مواردي است که در چگونگي درمان و وضعيت باليني تاثير دارد. تعيين مرحله بيماري، کوششي دقيق جهت اطلاع از توسعه و پيشرفت سرطان و اين که سلول‌هاي سرطاني کدام بخش‌هاي بدن را درگير کرده اند، مي‌باشد. همچنين به پزشک کمک مي‌کند تا برنام? درماني را طراحي نمايد. يکي از ابزارهايي که پزشکان براي توصيف مراحل سرطان استفاده مي‌کنند سيستم TNM است به طوري که پنج مرحله بيماري عبارت است از:
مرحله:I در اين مرحله سلول‌هاي توموري فقط محدود به بافت منشاء آنها هستند و مي‌توان با جراحي آن را از بين برد.
مرحله :II سرطان در همان ناحيه ابتدايي پيشرفت کرده است و به بافتهاي مجاور دست اندازي کرده است.
مرحله :III در اين مرحله نيز سرطان در همان ناحيه گسترش يافته است و احتمالاٌ اندام و تاحدي قده هاي لنفاوي کناري را نيز درگير کرده است.
مرحله :IV سرطان به ساير قسمت‌هاي بدن انتشار يافته است. سرطان معده تقريباً در هر جاي بدن مي‌تواند انتشار يابد از قبيل کبد، ريه‌ها، مغز و استخوان‌ها. اين مرحله نيز مي‌تواند با شيمي درماني، راديو درماني و جراحي نيز بهبود يابد.

سرطان معده شامل پنج مرحله ميباشد:
1.مرحله صفر کارسينوماي درجا(carcinoma in situ)، در مرحله صف، سلولهاي غير عادي در ساختار لايه مخاطي(داخلي ترين لايه) ديواره معده يافت مي شوند. اين سلولهاي غير عادي که ممکن است تبديل به سرطان شوند و به بافت هاي سالم مجاور سرايت کنند. مرحله صفر کارسينوماي درجا ناميده مي شود.
2.مرحله يک(I)، در اين مرحله سرطان تشکيل شده است، بسته به اينکه در کجا منتشر شده به مرحله(IA) و (IB) تقسيم ميشود.
– مرحله (IA): سرطان در لايه مخاطي ديواره معده کاملا رسوخ کرده است.
– مرحله (IB): سرطان در بخش هاي لايه مخاطي ديواره معده و تا شش غده لنفاوي مجاور تومور يا در لايه ماهيچه اي (مياني) ديواره معده گسترش يافته است.
3.مرحله دوم (II): در اين مرحله سرطان کاملا در لايه مخاطي ديواره معده و در هفت الي پانزده غده لنفاوي مجاور تومور يافت ميشود.و يا در لايه سروزي(بيروني ترين لايه) ديواره معده پيشروي کرده ولي به هيچ غده يا اندام ديگري رسوخ نکرده است.
4.مرحله سوم (III): در اين مرحله سرطان به اندام هاي مجاور معده غدد لنفاوي و بخش هاي ديگر بدن گسترش يافته است.
5.سرطان معده عود کننده: در اين مرحله سرطان به حدي پيشرفت کرده است که پس از درمان دوباره عود ميکند.
1-2-6- سير باليني بيماري
سرطان معده در طول مدت زمان نامشخصي از شروع بيماري، فاقد هر گونه علامت باليني است و اولين علائم آن زماني ظاهر مي‌شود که کاهش وزن بيمار به علت بي‌اشتهايي ايجاد مي‌شود.
رشد تهاجمي بي سر و صداي اين بيماري، معمولا منتهي به ضايعات پيشرفته در زمان تشخيص مي‌شود تا جايي که، درمان جراحي آن مشکل شده و حتي با روش‌هاي استاندارد درماني با جراحي يا اشعه با دوز بالا، 70 درصد مبتلايان در عرض يک سال بعد از تشخيص فوت مي‌کنند. ميزان بقاي 5 ساله بيماران، 5 تا 20 درصد گزارش شده است.
درمان‌هاي مختلف و ترکيب‌هاي درماني متعددي براي کنترل سرطان و يا بهبود کيفيت زندگي بيماران از طريق کاهش علائم و نشانه ها مورد استفاده قرار مي‌گيرد(Tsunehiro Takahashi et al., 2013).
همچنين سرطان معده به وسيله يکي از راههاي زير و يا ترکيب آنها با هم تاحدودي قابل درمان است واحتمالا شانس بقاي بيمار را بالا مي برد:
-جراحي برداشتن معده(gastrectomy ) که براي برداشتن کل معده و يا بخشي از معده وهمچنين نواحي اطراف آن انجام مي شود.
-شيمي درماني
شيمي درماني (به آن کِموتراپي هم گفته مي شود) نوعي از درمان سرطان است که در آن از دارو براي نابود کردن سلول هاي سرطاني استفاده مي شود.
-پرتو درماني
پرتو درماني ( Radiotherapy ) استفاده از پرتوهاي يونساز براي ازبين بردن يا كوچك كردن بافتهاي سرطاني است . در اين روش در اثر آسيب DNA ، سلولهاي ناحيه درمان ( بافت هدف ) تخريب و ادامه رشد و تقسيم غير ممكن ميشود . اگرچه پرتو علاوه بر سلولهاي سرطاني به سلولهاي سالم نيز آسيب ميرساند ولي اكثر سلولهاي سالم بهبودي خود را دوباره بدست مي آورند( et al., 2009 Cech T ). هدف از پرتو درماني از بين بردن حداكثر سلولهاي سرطاني با حداقل آسيب به بافت هاي سالم است . روشهاي مختلفي براي پرتودهي و انتقال اشعه با قدرت نفوذ متفاوت وجود دارد ، علاوه براين تعدادي از روشهاي پرتو دهي ميتواند بطور دقيق و كنترل شده براي درمان ناحيه كوچكي از بافت بدون آسيب به بافت و اندام هاي اطراف استفاده شود ، در حاليكه براي درمان نواحي بزرگتر از انواع ديگر پرتو استفاده ميشود . درتعدادي از بيماران هدف از درمان تخريب كامل تومور و بعضي كوچك كردن تومور يا كاهش علائم آن است . در هر بيمار طراحي درمان براي محافظت بافت هاي سالم تا حدامكان انجام ميشود . نيمي از بيماران سرطاني پرتودرماني‌ ميشوند . پرتودرماني ممكن است بصورت منفرد يا همراه با ديگر روشهاي درمان سرطان ( شيمي درماني يا جراحي ) مورد استفاده قرار گيرد حتي دربعضي موارد ممكن است بيش از يك روش پرتودرماني به كار گرفته شود .
1-2-7- ارتباط سرطان معده و ميکرو RNA
يکي از دلايل انتخاب اين موضوع براي تحقيق تشخيص زودهنگام سرطان معده به وسيله ي بررسي ميزان افزايش ميکرو RNAي 21 در سرم بيماران مبتلا به آدنو کارسينوماي معده ميباشد. ميکرو RNA ها زير گروه بزرگي از RNA هاي غير کد کننده 18 تا 25 نوکلئوتيدي هستند که از نظر تکاملي حفاظت شده مي باشند(Ruan K et al., 2009). اين مولکول ها بيان ژن را پس از رونويسي از طريق مهار ترجمه mrna يا القا نجزيه آن کنترل مي کنند و اين کار را از طريق اتصال به ناحيه ترجمه نشدني انتهاي mrna ها انجام ميدهند. رونوشت هاي اوليه ميکرو RNA طي دو مرحله پردازش توسط دو آنزيم RNaseIII يعني Drosha و Dicer تبديل به مولکول بالغ کوتاه تري مي شود(Babashah S et al., 20011). بيوژنز ميکرو RNA ها در هسته و سيتوپلاسم صورت ميگيرد. رونوشت آغازين ميکرو RNA ها چندين کيلو جفت باز طول دارد و توسط RNA پلي مراز II رونويسي شده و پلي آدنيله ميشود. ساختار ساقه- حلقه اين رونوشت ها توسط يک کمپلکس آنزيمي مستقر در هسته که 650 کيلو دالتون وزن دارد تشخيص داده شده و پردازش ميشود. کمپلکس مذکور حاوي يک III RNAse مخصوص برش RNA دو رشته اي به نام Drosha و پروتئين متصل شونده به RNA دو رشته اي است. پردازش اوليه منجر به ايجاد يک پيش ساز سنجاق سري 60-110 نوکلئوتيدي مي شود، که اين ميکرو RNA پيش ساز توسط فاکتور صادر کننده هسته اي Exportin-5 و فاکتور کمکي Ran-GTP به سيتوپلاسم منتقل ميشود. در سيتوپلاسم III RNAseديگري به نام Dicer منجر به پردازش نهايي ميکرو RNA ميشود. Dicer به همراه عامل کمکي متصل شونده به RNA دو رشته اي لوپ انتهايي Pri-miRNA را برش ميدهد و ميکرو RNA ( دورشته اي) 22-19 نوکلئوتيدي را ايجاد ميکند. معمولا فقط يک رشته از ميکروRNA بالغ دو رشته اي، به نام رشته راهنما به کمپلکس ميکروريبونوکلئوپروتئيني وارد شده و يک miRISC را ايجاد ميکند که توالي اين رشته جايگاه اتصال به mRNA هدف را مشخص ميکند(Wiemer EA et al., 2007). از آنجايي که فقط يکي از رشته هاي دوتايي ميکرو RNA ميتواند نقش رشته راهنما و هدايت کننده RISC به mRNA 3’UTRهاي هدف را بر اساس جفت شدن با mRNA ايفا کند، رشته دوم (پسنجر ) حذف ميشود. رشته حاوي جفت باز ضعيف در پايانه5′ به عنوان رشته راهنما انتخاب ميگردد(Kanellopoulou C et al., 2008). ميکروRNAهاي متصل شونده به RISC به mRNA 3’UTR هم جنس جفت ميشوند و پس از رونويسي ژن، بيان آنرا از طريق برش يا مهار ترجمه mRNA هدف کنترل ميکنند.
شکل 1-3 عملکرد ميکرو RNA: اين شکل عملکرد و پردازش ميکرو RNA در سلول را نشان ميدهد، که داراي چندين مرحله ميباشد (Gianpiero 2013).
سال 1993 اولين ميکرو RNA به نام LIN-4 (lineage-4) در Caenorhabditis elegans کشف شد، اما اهميت اين مولکول به عنوان يک تنظيم کننده ي زيستي تا سال 2001 که نمونه ي ديگري به نام Let-7 شناسايي شد، هنوز مشخص نشده بود(Büssing I et al., 2008). در سال 2001 فقط پنج مقاله در مورد ميکرو RNA ها نوشته شده بود، در حالي که تا سال 2008 حدود 3500 مقاله در پايگاه داده هاي Pubmed منتشر شد که 1500 مقاله فقط مربوط به سال 2008 بود(Cho WC et al., 2010). توجه بيش از پيش به ساختار و عملکرد ميکرو RNA ها به علت تاثيرآنها در فرايندهاي متنوع تکويني و فيزيولوژيکي مانند آپوپتوز، ترشح انسولين، خون سازي، ريخت زايي مغز يا تمايز بافتي، و درگيري آن ها در دفاع ايمني و بيماري هاي ويروسي است(Giovannetti E et al.,2011). ميکرو RNA ها مي توانند به عنوان انکوژن و يا مهار کننده تومور از طريق مهار بيان ژن هاي هدف وابسته به سرطان عمل کنند. از اين رو مي توان از ميکرو RNA هاي سرطاني به عنوان نشانگرهاي زيستي براي تشخيص، پيش بيني و حتي درمان استفاده کرد(Hanahan D et al., 2011). تغييرات افزايشي يا کاهشي بيان برخي ميکرو RNAها که منجربه روند سرطاني مي شوند، از طريق ايجاد تداخل با تنظيم کننده هاي چرخه سلولي، رشد سلول را تحت تاثير قرار ميدهند. ميکرو RNAها يکي از تنظيم کننده هاي اصلي مرگ برنامه ريزي شده سلول در فرايند تومورزايي هستند و بقاي سلول هاي سرطاني با دستکاري اين ميکروRNA ها کنترل ميشود. از طرف ديگر سلول هاي سرطاني ويژگي ناميرايي خود را با حفظ تلومرها از طريق تنظيم مثبت تلومراز و زياد شدن طول تلومرها بدست مي آورند. ناهنجاري ميکروRNA يکي از عوامل فعاليت زياد تلومراز در تومورهاست. قابل ذکر است که بيش از نيمي از ميکرو RNAها در مناطق ناپايدار ژنومي يا جايگاه هاي شکننده کروموزوم ها که با سرطان هاي متنوعي همراه هستند به صورت خوشه اي قرار گرفته اند(lim et al., 2010). ميکرو RNA ها نقش مهمي را در تنظيم پاسخ هاي ايمني در سرطان ايفا ميکنند. ميزان بيان ميکرو RNA هاي 21، 31، 143 و 145 در بافت توموري نسبت به بافت غير توموري تغيير ميکند. ميزان بعضي ميکرو RNA ها مانند mir-21 در بافت توموري سرطان معده نسبت به بافت سالم افزايش چشمگيري نشان مي دهد و با stage و اندازه تومور ارتباط معني داري نشان ميدهد. ميزان بيان miR-21 در بافت توموري سرطان معده ارتباط معني داري با stage باليني تومور نشان ميدهد. Stage ميزان تهاجم بافت تومور را نشان ميدهد، Mi RNA-21 يکي از ميکرو RNA هايي است که به شدت مورد مطالعه قرار گرفته است، بيان اين ميکرو RNA در انواع مختلفي از سرطان ها افزايش ميابد، به تازگي اثبات شده که که miR-21 در تقريبا همه مراحل تشکيل تومور هاي سرطاني نقش دارد . miR-21 باعث تحريک تکثير و تهاجم سلولي شده و آپوپتوزيس(apoptosis ) سلولي را مهار ميکند. بنابراين اين مولکول به عنوان يک انکومير(oncomir)شناخته ميشود. همچنين افزايش اين ميکرو RNA باعث کاهش بيان پروتئين هاي بازدارنده تومور و افزايش بيان پروتئين هاي انکوژن ميشود. با توجه به اين نقش ها Mir-21 ميتواند گزينه مناسبي جهت بررسي ايجاد سرطان و متاستاز باشد. با توجه به افزايش بيان اين انکومير در بافتهاي سرطاني مي توان از آن براي تشخيص به موقع و پيشگيري از متاستاز بهره برد و چون اين ميکروRNA بر روي سلول هاي تومور اثر گذاشته و خاصيت آنکوژني و ضد آپوپتوزي دارد باعث اختلال در مسير آپوپتوز ميگردد که به نفع بقاي سلول سرطاني مي باشد. مطالعه بر روي نقش ضد آپوپتوزي اين بيومارکر تا حدي نامشخص باقي مانده است با اين وجود با توجه به اطلاعات فوق تحقيقات روي آن مي تواند چشم اندازي در تشخيص مراحل اوليه و درمان سرطان باشد. در مطالعات باليني نشان داده شده است که بيان miR-21 در بافت توموري سرطان معده در مقايسه با بافت سالم کناري آن به شدت بالاتر مي رود. افزايش ميزان miR-21 در بافت توموري سرطان معده با قدرت تهاجم بيماري، اندازه تومور،و مرحله بندي ارتباط قوي نشان داده است]7[. همچنين رد پاي miR-21 در تقريبا تمامي سرطانها از جمله سرطان سينه، مري، معده، ريه، تخمدان، لنفوم، کبد، دهانه رحم، گردن و غيره مشاهده شده است که بيان اين ميکرو RNA در تمامي اين سرطانها افزايش چشمگيري را نشان مي دهد. افزايش اين ميکروRNA باعث کاهش بيان پروتئين هاي بازدارنده تومور و افزايش بيان پروتئين هاي آنکوژن مي شود. مطالعات يک نقش کليدي را براي گروه miR-21 در پاتوژنز سرطان ثابت ميکند. همچنين در سلولهاي سرطان روده بزرگ miR-21 منجربه پيشرفت تومورزايي ميشود (Wang et al., 2009).



قیمت: تومان


پاسخ دهید