چکيده
مقدمه: اعضاي جنس مالاسزيا مخمرهاي چربي دوست هستند که فلور طبيعي پوست انسان و حيوانات خونگرم بوده و با تعدادي بيماري هاي پوست مرتبط مي باشند. اين ارگانيسم در شرايط خاصي مسبب بيماري پيتريازيس ورسيکالر و درماتيت سبوروئيک مي باشد. گونه هاي مالاسزيا را مي توان از طريق خصوصيات مرفولوژيک و بيوشيميايي شناسايي کرد ولي اين روش هاي فنوتيپي معمولا زمانبر و فاقد قدرت تمايز کافي است، لذا روشهاي مولکولي شناسايي سريعتر و صحيح تري را فراهم مي کنند هدف از اين مطالعه جداسازي و تشخيص گونه هاي مالاسزيا با استفاده از محيط کشت کروم آگار اصلاح شده و تاييد آن به روش PCR در شهر اهواز مي باشد.
روش کار:استخراج DNA روي 9 مخمر مالاسزياي رشد يافته روي محيط کشت کروم آگار اصلاح شده انجام شد سپس آزمايش PCR با پرايمرهاي (Forward) 18SF1 و (Reverse) 58SR بر روي 9 DNA مالاسزيايي جدا شده انجام گرديده و قطعه ي هدف (ناحيه ITS1rDNA) براي کليه ي ايزوله ها قطعات متفاوتي به اندازه ي 280 تا 400 جفت باز تقويت شد.
نتايج: از 30 نمونه کشت داده شده در محيط کشت کروم آگار اصلاح شده 29 مورد کشت مثبت و 1 مورد کشت منفي شدند. از 9 نمونه شوره سر بيماران پتريازيس ورسيکالر 8 مورد باند داده و يک مورد باند تشکيل ندادند همچنين 2 نمونه مالاسزيا گلوبوزا و مالاسزيا رستريکتا از 9 نمونه تاييد شده بدست آمد.
نتيجه گيري: شايعترين گونه ي جدا شده از نمونه هاي گونه سر مالاسزيا گلوبوزا و مالاسزيا رستريکتا بود. گونه هاي مالاسزيا روي محيط کشت کروم آگار اصلاح شده سريعتر و بهتر از محيط کشت ديکسون آگار و ليمينگ نوتمن آگار رشد کردندو توصيه مي شود از اين محيط کشت براي شناسايي در آزمايشگاههاي بيشتري مورد استفاده قرار گيرد.
واژگان کليدي: شناسايي، محيط کشت کروم آگار اصلاح شده، PCR، ITSrDNA، مالاسزيا، پيتريازيس ورسيکالر
فصل اول
مقدمه
مقدمه
شايع ترين بيماري هاي عفوني در انسان عفونتهاي قارچي سطحي و جلدي هستند که توسط قارچ هايي نظير درماتوفيتها، بعضي از قارچ هاي فرصت طلب، کانديدا، مالاسزيا، آسپرژيلوس، ترايکوسپورون ايجاد مي شوند(35)
ضايعات عفونتهاي قارچي سطحي محدود به خارجي ترين طبقه شاخي پوست و يا قسمتهايي از ساقه مو که در خارج از پوست بدن قرار دارند مي شوند. عفونت هيچگاه به طبقات عميق تر ايپدرم و فوليکول مو نفوذ نمي کند(2) و سيستم ايمني به حضور قارچ پاسخ نمي دهد (35) و در اکثر موارد بيماري به صورت مزمن مشاهده مي شود (12).

فوليکوليت مالاسزيايي
فوليکوليت فرم شديد بيماري پيتريازيس ورسيکالر مي باشد که به صورت پاپولي هاي فوليکولار و ملتهب يا پوستول دار به اندازه 4-2 ميلي متر بر روي پشت، بازوها، گردن و ندرتا صورت که اغلب با خارش همراه است ، مشاهده مي شود (2). اين بيماري در آب و هواي گرمسيري بيشتر شيوع دارد (7). فاکتورهايي نظير ديابت، سندروم کوشينگ، نقص کليه، پيوند کليه و ديگر اعضاء بدن ، آنتي بيوتيک هاي وسيع الطيف و استروئيد درماني در بيماري نقش به سزايي دارند(2).
التهاب کيسه و مجراي اشکي
در اين بيماري گونه هاي مالاسزيا در کيسه اشکي کلنيزه شده و سبب بزرگ شدن و التهاب آن مي گردد. در بعضي موارد انسداد گسترش يافته و سبب التهاب و تداخل با عمل ريزش طبيعي اشک مي شود(2و3).
درماتيت سبوروئيک
درماتيت سبوره که شايع ترين نشانه کلينيکي آن توليد شوره سر است بيماري مزمن، عود کننده ، خارش دار، و پوسته ريزي دهنده پوست مي باشد. علائم بيماري به صورت ضايعات شوره زاري در سر ، صورت ، عانه و ساير قسمت هاي بدن تظاهر مي کند(2و7). مالاسزيافور فرو (پي تي روسپوروم اووال) عامل درماتيت سبوروئيک است (2). شيوع اين بيماري در مردان بيشتر از زنان است و در بيماراني که داراي نقص ايمني هستند شيوع بالايي دارد(7). فاکتورهاي زمينه اي مناسب براي بيماري عبارتند از : اختلالات غدد داخلي بدن و ترشح غدد چربي به ميزان زياد.
درماتيت آتوپيک
نوعي بيماري پوستي التهابي، عود کننده و مزمن است که بوسيله زخم هاي پوستي اگزمائي و خارش دار مشخص مي شوند. گزارشات متعددي مبني بر نقش گونه هاي مالاسزيا در تشديد ضايعات درماتيت آتوپيک وجود دارد (27و59).
پيتريازيس ورسيکالر
پيتريازيس ورسيکالر عفونت قارچي سطحي ، مزمن و آرام لايه شاخي پوست است که با ايجاد ضايعات ماکولر پوسته دار صاف يا کمي برجسته مشخص مي شود (13و59و78). ضايعات به رنگهاي مختلف سفيد، صورتي ، زرد ، قهوه اي روشن يا قهوه اي تيره ديده مي شوند(27) و در نقاطي از بدن بيشترند که غني از غدد سباسه باشد(93). ضايعات به شکل لکه هاي سطحي نامنظم يا گرد، جدا از هم يا به هم پيوسته اند. اندازه ضايعات در ابتدا ريز و چندتايي هستند و به سرعت بزرگ مي شوند(37) که شبيه نقشه جغرافيا ديده مي شوند (24). ضايعات بيماري به صورت ماکول هاي هيپوپيگمانته1 و هيپرپيگمانته2 مي باشند.
رنگ ضايعات در افراد با پوست تيره (سيا پوستان) معمولاً روشن و در سفيد پوستان زرد تا قهوه اي مي باشد (تصوير شماره 1).
تصوير 1-1- ضايعات پيتريازيس ورسي کالر الف: پوست روشن ب: پوست تيره
در اشکال مزمن بيماري نواحي هيپوپيگمنت (ضايعات جوان) و هيپرپيگمنت (ضايعات مسن) با هم ديده مي شوند(2). محل ضايعات به طور شايع روي بالا تنه، سينه، پشت، شانه ها و زير بغل است و به نواحي ديگر مثل گردن، صورت و بازوها پخش ميشود (27).
نمودار1-1- فراواني ضايعات در نقاط مختلف بدن
شروع پيتريازيس و رسيکالر آهسته و بدون علامت خاص است دوره کمون بيماري بين يک الي دو ماه است و در بعضي افراد، خارش مختصري نيز وجود دارد به خصوص زماني که اين افراد عرق مي کنند(47). در نواحي گرم و نيمه گرم درگيري صورت شايع است ولي در آب و هواي معتدل شايع نيست. در يک بررسي درگيري نواحي غير شايع مثل پلک چشم وپنيس گزارش شده است. گاهي نيز درگيري کشاله ران نيز گزارش شده که در اين مورد تمايز آن ازاريتراسما خيلي مشکل است اما در موارد استثنا، عفونت همزمان پيتريازيس و رسيکالرواريتراسما در کشاله ران گزارش شده است (27). بيماري پيتريازيس ورسيکالر انتشار جهاني داشته ولي در مناطق گرمسيري ، مرطوب و معتدل به ويژه در فصول تابستان و پاييز شايعتر است. به طول کلي شيوع جهاني بيماري 8-2% و در نواحي سرد به کمتر از 1/1% است (2و28و48). تينه آورسيکالر در ايران در مناطق گرم و مرطوب جنوبي (بندرعباس، بوشهر، کازرون، آبادان و اهواز)، سواحل درياي مازندران (دشت گرگان، رامسر،بابل رشت) و نواحي جنوب درياچه اروميه شيوع فراوان داشته و در فلات مرکزي ، تهران، اصفهان و مشهد نيز ديده مي شود (2و9). اين بيماري در مکزيک، آمريکاي جنوبي، هند، قسمتهايي از آفريقا،کوبا، فيجي و اطراف درياي مديترانه موارد بالاي 50% گزارش شده است. ظاهر ميکروسکوپي ارگانيسم در مناطق گرم با مناطق معتدل متفاوت است. بيماري در هر دو نژاد سياه و سفيد ديده مي شود و با اينکه تغييرات رنگ پوست در سياهپوستان بيشتر است اما شيوع بيماري در هر دو نژاد يکسان است(53). انتقال بيماري در سفيد پوستان شايعتر از سياهپوستان است(4). بيماري در مردان بيشتر از زنان است که علت آن را بالا بودن ميزان دهيدرو تستسترون در پوست پسران نوجوان مي دانند که منجر به افزايش ترشح بيشتر سبوم در اين سن مي شود. محققين ديگر گزارش داده اند که شيوع بيماري در زنان بيشتر بوده و دليل آن را به توجه زيادي که زنان به زيباي و بهداشت پوست دارند، نسبت داده اند(71). تينه آورسيکالر در سنين نوجواني و ميانسالي که غدد سباسه بيشترين فعاليت خود را دارند رايج است، با اينجال در افراد مسن و بچه ها نيز گزارش شده است(53). در بعضي از شرايط آب و هوايي (گرمسيري) فرم شديد بيماري در نوزادان ايجاد مي شود که به نام پيتريازيس ورسيکالر آلبا ويا آکروميا پارازيتيکا ناميده مي شود (5). در آمريکا در سنين 24-15 سال رايج است. در حالي که در ايران در سنين 40-20 سال ديده مي شود (71)
تصوير 2-1- درگيري صورت در آب و هواي گرم و نيمه گرم
نمودار 2-1- شيوع بيماري تينه آورسيکالر در نقاط مختلف ايران
فاکتورهاي مستعد کننده بيماري
اگر چه گونه هاي مالاسزيا به عنوان فلور پوست مطرح شده اند ولي برخي فاکتورهاي اندوژن و اگزوژن در تبديل آنها به فرم بيماري زا دخالت دارند. رطوبت ، سوء تغذيه ، افزايش سطح کورتيزول پلاسما، چربي پوست، مصرف بي رويه آنتي بيوتيک ها و کورتيکوستروئيدها، حاملگي ، ديابت، علل ژنتيکي ، استرس، عفونت هاي مزمن، فقر بهداشتي ، پوشش هاي تنگ و نايلوني و تعريق فراوان از جمله اين فاکتورها محسوب مي گردند. (13و59) و با توجه به چربي دوست بودن عامل بيماري ، حدس مي زنند که نرم کننده ها و روغن هاي مورد استفاده براي پوست در ايجاد بيماري دخالت داشته باشند (6).
بيماريزايي مالاسزيا
تغييرات رنگ پوست که مشخصه عفونت ورسيکالر مي باشد به دنبال مهار تشکيل ملانين اتفاق مي افتد. سوبسترايي چون آزوليک اسيد که توسط مالاسزيا در اپيدرم توليد مي شود سبب مهار اين پروسه مي گردد. مطالعات نشان مي دهد که ملاسزيا فورفور هنگام رشد روي محيط کشت محتوي اولئيک اسيد و يا واکسنيک اسيد توليد دي کربوکسيليک با C9-C11 مي نمايد. دي کربوکسليک اسيدهاي C8-C13 قادرند تيروزيناز آنزيم کليدي در سنتز ملانين را مهار نمايند. اين عمل سبب مي شود که در محل ضايعه رنگيزه ساخته نشود و پوست آن ناحيه بي رنگ گردد. در ضايعات هيپرپيگمنت، مالاسزيا سبب افزايش ميزان ملانوزوم هاي توليدي توسط ملانوسيت در اپيدرم مي گردد و اين عمل سبب رنگ قهوه اي ضايعات مي گردد (2و36). مطالعات در invitro نشان مي دهد که آسپاراژين رشد مالاسزيا فور فور را تحريک مي کند. در حالي که گليسين تشکيل هيف را تحريک مي کند . بعضي از مطالعات نشان مي دهد که لنفوسيت هايTدر بيماريزايي بي تاثير است (2).
گونه هاي مالاسزيا بر خلاف اکثر ميکرو ارگانيسمهاي بيماريزا ، سيستم ايمني بيماران مبتلا به پيتريازيس ورسيکالر را مهار مي کنند و در نتيجه در پوست اين افراد التهاب ايجاد نمي شود . در گونه هاي مالاسزيايي که کپسول غني از ليپيد دارند. کراتينوسيت ها ، منونوکلئرهاي خون محيطي را تحريک مي کند تا با استفاده از مسير وابسته به IL10 (افزايش IL10 )سايتوکين هاي پيش التهابي را که شامل?-IL-6 IL-1 TNF-باشند، کاهش دهد، در نتيجه التهاب ايجاد نمي شود. همچنين مالاسزيا ماده اي به نام پيتريارو بين توليد مي کند که يک آلکالوئيد ايندول قرمز رنگ است . اين ماده در invitro انفجار تنفس نوتروفيل ها را مهار مي کند و همچنين 5- ليپواکسيژناز را که يک ماده درگير در توليد واسطه هاي التهابي است، مهار مي کند. توانايي مالاسزيا در کاهش سيستم ايمني به مالاسزيا اين توانايي ر ا مي دهد که روي پوست افراد سالم به عنوان فلورنرمال رشد کند (36).
جنس مالاسزيا
جنس مالاسزيا در شاخه بازيديوميکوتا و در خانواده کريپتوکو کاسه قرار مي گيرد.اين جنس اولين بار در سال 1846 به عنوان علت بيماري پيتيريازيس ورسيکالر کشف و تحت عنوان پيتيروسپوروم نام گذاري شد و گونه هاي پيتيروسپوروم اربيکولار و پيتيروسپوروم اووال و پيتيروسپوروم پاکي در ماتيس در اين جنس توصيف گرديد. سپس پيتيروسپوروم به مالاسزيا تغيير نام داده و در سال 1990 گونه چهارمي تحت عنوان مالاسزيا سيمپودياليس اضافه گرديد (49). در سال 1995 گيلوت و گهو (38) بر اساس مطالعات ژنتيکي از جمله درصد مولار G+C در DAN و آناليز توالي هاي RNA ريبوزومي در کنار مورفولوژي و فيزيولوژي قارچ ها، 7 گونه مالاسزيا شامل مالاسزيا پاکي درماتيس، مالاسزيا فورفور ، مالاسزيا رستريکتا، مالاسزيا اسلوفيه، مالاسزيا گلوبوزا، مالاسزيا سمپوديا ليس، مالاسزيا ابتوزا توصيف و پذيرفته شد. در سال هاي اخير بر اساس داده هاي مولکولي 7 گونه جديد تحت عنوان مالاسزيا نانا (27) مالاسزيا درماتيس(59) مالاسزيا ژاپونيکا (78) مالاسزيا ياما توئنسيس (93) ، مالاسزيا اکوئينا، مالاسزيا کاپرا، مالاسزياکونيکولي به جمع مالاسزياها اضافه شد که در کل 14 گونه مالاسزيا شناخته شده که در نواحي مختلف جهان فراواني متفاوتي از انها گزارش گرديده است (15). در بررسي که خانم شکوهي و همکاران در سال 2009 در ساري انجام داده گونه غالبي مالاسزيا گلوبوزا با فراواني 3/53 درصد بود . که نتايج بدست امده توسط ناکابايشي و دو تا هماهنگ است (33و79). اما از نتايج بدست امده توسط شمس (73 درصد) کمتر مي باشد (80). در مطالعه گوپتا گونه غالب جدا شده مالاسزيا سمپودياليس (4/59 درصد) بوده، مالاسزيا گلوبوزا با اختلاف زيادي در رتبه دوم قرار داشت؛ هر چند که وي در بررسي نمونه هاي پيتريازيس ورسيکالر نواحي گرمسيري خارج کانادا، مالاسزيا گلوبوزا را به عنوان گونه غالب گزارش نمود(39). مخمرهاي فرصت طلب جنس مالاسزيا ارگانيزمهاي هم سفره اي هستند که روي پوست انسان حضور دارند و با تعدادي بيماري هاي پوست مرتبط مي باشند (10و17). گونه هاي مالاسزيا به صورت دي مورفيسم هستند و دو فاز مخمري و ميسليال را تشکيل مي دهند. تبديل فرم مخمري مالاسزيا به فرم ميسليال باعث ايجاد بيماري پيتريازيس ورسيکالر مي شود که فرم ميسليال توانايي حمله به استراتوم کورنئوم و نفوذ به داخل يا بين کورنئويست ها را دارد (57). گونه هاي مالاسزيا عمدتاً از اسيدهاي چرب آزاد اشباع و غير اشباع با تعداد کربن هاي 24-12 عدد جهت رشد خود استفاده مي کنند. اين قارچ ها قادر هستند تري گليسريدها را مستقيما به اسيدهاي چرب تبديل کنند و مورد استفاده قرار دهند، به همين دليل گونه هاي مالاسزيا در نواحي از بدن که غني از غدد سباسه هستند رشد بهتري دارند.
گونه هاي مالاسزيا علاوه بر انسان به طور وسيعي از پستانداران و پرندگان جدا شده اما هرگز از خاک جدا نشده است. مالاسزيا پاکي درماتيس از مجراي گوش سگ، خوک، گربه و پوست خرس و فيل و گاهي از ضايعات انساني نيز جدا شده است و بر خلاف ساير گونه هاي مالاسزيا چربي دوست نبوده و براي رشد نياز به ليپيد ندارد (4).
تشخيص آزمايشگاهي پيتريازيس ورسيکالر
تشخيص آزمايشگاهي شامل نمونه گيري از شوره سر افراد نرمال و بيمار مي باشد. با کمک روش هاي مختلف تشخيص گونه هاي مالاسزيا ، مانند استفاده از خصوصيات مورفولوژيکي ، بيوشيميايي و روش هاي مولکولي مي توان به وجود انها و هم چنين ارتباط انها با بيماري هاي مختلف پي برد(13).
روش هاي مورفولوژيکي
ازمايش مستقيم با تهيه نمونه از پوسته ها با کمک پتاس 20-10% و رنگ اميزي پوسته ها بامتيلن بلويا جوهر پارکر، PAS، گرم ، کالکوفلوئورسفيد و کريستال و يوله و مشاهده سلول هاي مخمري زياد و مجموعه هيف ها وکونيديا که اسپاگتي و meat balls ناميده مي شوند استفاده مي شد (2). براي شناسايي از لامپ وود هم مي توان استفاده کرد اما اين روش فقط در يک سوم موارد پيتريازيس ورسيکالر مثبت است(33). استفاده از لامپ وود و ديدن فلورسانس، مي تواند وسعت ضايعات را برروي بدن تعيين نمايد. ويژگي هاي مورفولوژيک خاص اين عوامل در نمونه هاي پوست براي تشخيص فوري انها به عنوان جنس مالاسزيا کفايت مي کند. ويژگي اصلي اين سلولها، نحوه تقسيم انهاست که به طريق جوانه زني تک قطبي بوده و قاعده جوانه اثريقه مانندي ايجاد مي کند، با وجود اين ، مخمرها از نظر شکل متنوع بوده و در نمونه هاي پاتولوژيک به صورت کروي ، بيضي و يا کشيده ديده مي شوند. اشکال مختلفي ممکن است در يک محل کلونيزه شوند و يا اينکه اکثر انها به يک شکل ديده شوند. مخمرهاي کروي 2 تا 8 ميکرومتر قطر داشته که به شکل خوشه در کنار يکديگر قرار گرفته (بلاستوکونيدي) و اغلب همراه رشته هاي نامنظم به طول 10 الي 25 ميکرومتر و عرض 2 تا 5 ميکرومتر مي باشند. رشته ها از انتها بهم متصل بوده و در يک رديف قرار گرفته و يا از هم مجزا مي باشند. به طوري که ايجاد رشته هاي با تيغه مياني و زاويه دار را با طول هاي متغيير مي نمايند. اين شکل کلاسيک ارگانيسم است که در موارد پيتريازيس ورسيکالر در مناطق معتدل ديده مي شود.
ظاهر قارچ در مناطق گرمسير و گاهي در مناطق معتدل در پوست به شکل مخمرهاي بيضي و يا کشيده همراه با رشته هاي فوق الذکر مي باشد. اين ظاهر کاملاً مشخص مي تواند نشان دهنده عفونت حاصل از گونه هاي مختلف مالاسزيا باشد. به همين دليل مطالعات مقايسه اي با استفاده از شاخص هاي ايمونولوژيک و مولکولي و نيز کشت لازم است تا گونه هاي ايجاد کننده عفونت را شناسايي نموده و بدين ترتيب مشخص گردد که در ايجاد پيتريازيس ورسيکالر بيش از يک گونه دخالت دراند (80).
تصوير3-1- منظره ميکروسکوپي الف: پيترياريس ورسي کالر ب: درماتيت سبوروئيک
کشت
کشت ارگانيسم بسيار مشکل است و بايستي از محيط کشت غذايي ويژه اي استفاده شود . محيط کشت بايستي واجد اسيدهاي چرب C12-C14 باشد. تنها گونه اي که در محيط فاقد چربي توانايي رشد دارد، مالاسزيا پاکي درماتيس است که در روي محيط سابورو به راحتي رشد مي کند و از اين محيط براي افتراق مالاسزيا پاکي درماتيس از ساير گونه ها استفاده مي شود.
محيط هاي مورد استفاده براي کشت مالاسزيا
محيط سابورودکستروز اگار با روغن زيتون .
ترکيبات تشکيل دهنده اين محيط شامل ، 20 گرم گلوکز ، 10 گرم پپتون، 10 ميلي ليتر روغن زيتون، 5/0 گرم کلرامفنيکل ، 5/0 گرم سيکلوهگزاميد و 15-12 گرم آگار مي باشد (39).
محيط ديکسون اگار
اين محيط حاوي 3/6% عصاره مالت ، 6/0% پپتون، 2% صفرا، 1% توئين 40، 2/0% اسيداولئيک، 2/1% اگار، علاوه کلرامفنيکل و سيکلوهگزاميد است (28). مناسب ترين محيط براي شناسايي و تکثير کلني هاي مالاسزيا، محيط هايي نظير محيط ديکسون اگار است که چربي ها در ان به صورت مخلوط و امواسيفيه در امده است مي باشد. به اين صورت که بعد از حداقل 2 پاساژ کوتاه مدت جهت اطمينان از رشد فعال ارگانيسم و پس از 10 روز کلني ها مورد مطالعه قرار مي گيرند که اينکار از طريق مقايسه مشخصات ماکروسکوپي و ميکروسکوپي کلني ها با گونه هاي تاييد شده قبلي صورت مي گيرد (80).
محيط ushijima
ترکيبات محيط شامل 1% تريپتيکازپپتون ، 5/0% عصاره مخمر، 3/0% گلوکز، Nacl2/0% ، kh2po4 2/1% ، ، 5/1% اگار ،1/0% آمپي سيلين و 025/0% سيلوهگزاميد است . اين محيط براي رشد مالاسزيا پاکي درماتيس استفاده مي شود (89).
محيطLNA (leeming – notman agar)
اين محيط شامل 5/0 گرم گليسرول منواستراز، 20 گرم پپتون ، 5 گرم گلوکز، 1/0 گرم عصاره مخمر ، 4 گرم
صفرا، 12 گرم اگار، 5/0 ميلي ليتر T60، 1 ميلي ليتر گلسيرول ، 200 ميلي گرم سيکلوهگزاميد و 50 ميلي گرم کلرامفنيکل (54).
محيط کروم اگار کانديدا تغيير يافته
ترکيبا محيط شامل 3/56 گرم محيط پايه کروم اگار مالاسزيا و 10 ميلي ليتر توئين 40 مي باشد. اين محيط براي
شناسايي و تمايز 7 گونه مالاسازيا (مالاسزيا فورفور، مالاسزيا ابتوزا، مالاسزيا اسلوفيه، مالاسزيارستريکتا، مالاسزيا پاکي درماتيس ،مالاسزيا گلوبوزا،مالاسزيا سمپودياليس) بر اساس رنگ و سايز کلني که روي محيط تشکيل مي دهند استفاده مي شود (55و92).
روش هاي فيزيولوژيکي
جهت تشخيص گونه هاي مختلف مالاسزيا از تست هايي چون سنجش وابستگي به چربي ، کاتالاز، رشد در توئين 80،60،40،20 استفاده مي شود (2).
واکنش کاتالاز
آنزيم کاتالاز اب اکسيژنه را به اکسيژن و اب تجزيه و ميکرو ارگانيسم را در مقابل عمل کشنده اب اکسيژنه حفظ مي کند. براي انجام اين تست، روي لام تميز، يک قطره محلول پر اکسيد هيدروژن 3% و مالاسزيا مخلوط کرده و بهم زده ، در صورت توليد حباب، تست توليد کاتالاز مثبت است. تمام گونه هاي مالاسزيا به جز ء مالاسزيارستريکتا واجد انزيم کاتالاز هستند و از اين واکنش به منظور افتراق مالاسزيا رستريکتا از ساير گونه ها استفاده مي شود (77).
توليد رسوب
از محيط کروم آگار اصلاح شده + توئين 40 يا سابورود دکستروز + توئين 40 استفاده مي شود . از اين تست براي تمايز بعضي گونه هاي مالاسزيا استفاده مي شود ، زيرا گونه هاي مختلف از نظر توليد رسوب با هم فرق مي کنند . توليد رسوب به دليل توليد کريستال هاي نمک اسيدهاي چرب آزاد غير قابل حل از منابع چربي محيط کشت ، در اثر توليد آنزيم ليپاز توسط گونه هاي مختلف است . اين تست نشان مي دهد که گونه هاي مالاسزيا از نظر سيستم آنزيمي ليپاز با هم فرق مي کنند . اين تست درمالاسزيادرماتيس ، مالاسزيا سمپوديالميس، مالاسزياپاکي درماتيس و مالاسزياگلوبوزا مثبت است (55).
تست TE ( ESCULIN – TWEEN 60 )
اين محيط براي جداسازي گونه هايي که توانايي هيدروليز اسکولين و استفاده از توئين 40 را دارند ، بکار مي
رود . ترکيبات اين محيط شامل پپتون گلوکز ، عصاره مخمر ، ستيرات آمونيوم ، آهن و توئين 60 است . در گونه هاي مالاسزيا پاکي درماتيس ، مالاسزياسمپودياليس ، مالاسزياژاپونيکوم و مالاسزيافورفورتست TE مثبت هستند . به اين صورت که اطراف کلني هاله سياه توليد مي شود که علت آن توليدات هيدروليز اسکولين و نمک آهن فريک به خاطر ترشح آنزيم بتاگلوکوزيد از در محيط مي باشد (62).
تست EL ( CREMOPHOR EL )
اين تست توانايي جذب روغن کاستور ] ( CREMOPHOR EL ) CASTOR OIL 35 – PEG [ را توسط گونه هاي مالاسزيا نشان مي دهد . اين تست فقط در مالاسزيا فور فور مثبت است (55).
تست جذب توئين
مهم ترين تست فيزيولوژيکي براي افتراق گونه هاي مالاسزيا ، تست آسيميلاسيون چربي يا جذب توئين ) T80 و T60 ، T40 ، T20 ) است .
واکنش اوره آز
اين محيط شامل اوره و معرف فنل رد است . فقط مالاسزيافورفور و مالاسزيا پاکي درماتيس توانايي توليد آنزيم اوره آز را دارند اما بفيه مالاسزيا اوره آز منفي هستند (87) .
رشد روي محيط ديکسون آگار اصلاح شده در 3 درجه دمايي 32، 37 و 40 درجه سانتي گراد
تقريباً تمام گونه ها در 32 و 37 درجه سانتي گراد رشد مي کنند اما فقط گونه هاي مالاسزيا فور فور،مالاسزيا پاکي درماتيس ،مالاسزيا سمپودياليس ،مالاسزيا اسلوفيه ،مالاسزيا درماتيس در 40 درجه سانتيگراد قادر به رشد کردن هستند (55).
روشهاي مولکولي
روش هاي فنوتيپي که توضيح داده شد روش هايي هستند که بصورت رايج براي شناسايي و افتراق گونه ها استفاده مي شود. در سال هاي اخير روشهاي مولکولي پيشرفت هاي زيادي داشته اند و به خاطر مزايايي که دارند، جايگزين روش هاي مورفولوژيکي و فيزيولوژيکي شده اند. روش هاي فنوتيپي وقت گير و چند مرحله اي بوده و به تکنيکهاي آزمايشگاهي زيادي نياز دارند. علاوه بر اين به علت تشابهاتي که در خصوصيات فيزيولوژي و مورفولوژي بعضي مثل مالاسزيا فورفور، مالاسزيا سمپودياليس و مالاسزيا اسلوفيه وجود دارد (40) و همچنين با مشاهده استرين هاي مالاسزيا با خصوصيات فيزيولوژيکي غير معمول (29و30)، استفاده از اين روش ها در تمايزگونه ها ابهام و سردرگمي بوجود مي آورد (19و41).
مطالعات زيادي وجود دارند که نشان دهنده اختلاف نتايج روش هاي فنوتيپي و کشت با روش هاي مولکولي است. از جمله مطالعه Makimura که در سال2000 انجام شد ، 46 ايزوله باليني را ابتدا با روش هاي فنوتيپي و سپس باسکوئنسينگ ناحيهITS-1 شناسايي کرد. در روش هاي فنوتيپي استفاده شده، 46 ايزوله بعنوان مالاسزيا فورفور شناسايي شدند ولي باسکوئنسينگ ناحيه ITS-1 از ، 22 تا از 46 ايزوله، مالاسزيا سمپودياليس و5 تا مالاسزيا اسلوفيا شناسايي شدند (27).
در مطالعه ديگري که در سال 2000، Nakabayashi و همکاران از روش کشت براي تشخيص گونه ها در افراد سالم و بيمار (پيتريازيس ورسيکالر و سوريازيس) استفاده کرد، نتايج به اين صورت بودکه در افراد سالم و بيمار، مالاسزيا گلوبوزا فراوان ترين ايزوله بود ولي مطالعات ديگر با استفاده از روش هاي تشخيصي مولکولي مثل Nested-PCR و Real-time روي افراد سالم و بيمار (پيتريازيس ورسي کالر، سوريازيس و درماتيت آتوپيک)، نشان دادندکه فراوان ترين ايزوله مالاسزيا رستريکتا و مالاسزيا گلوبوزا بودند (72و81). تفاوت بين روش هاي مولکولي و تکنيک هاي کشت نشان دهنده خطاي در کشت است که علت آن مي تواند به خاطر برداشت آرتي فکت از کشت به جاي نمونه باشد و يا اينکه محيط کشت استفاده شده به طور استاندارد و دقيق ساخته نشده باشد (27).
از ديگرمعايب روش هاي فنوتيپي اين است که اجزاي علم رده بندي را در بر نمي گيرند و با استفاده از اين روش ها ارتباط ژنتيکي بين گونه ها را نمي توان تعيين کرد. بنابراين استفاده از روش هاي مورفولوژي و فيزيولوژيکي رايج براي تشخيص گونه هاي مالاسزيا باعث محدوديت در تشخيص و طبقه بندي گونه هاي جديد مي شود. در سال هاي اخير براي غلبه بر اين محدوديت ها و درک بهتر اپيدميولوژي و اکولوژي گونه هاي مالاسزيا و نيز ارتباط آنها با بيماري ها استفاده از روش هاي مولکولي مختلف رايج شده است (27و42و43و79) که شامل، Nested-PCR ،PFGE ، DGGE، RFLP، Tflp، SSCP، RAPD، AFLP، Real-time PCR، Sequence مي باشند (70و71). بطور کلي براي تشخيص ارگانيسم ها با استفاده از PCR، به نواحي هدف DNA مناسب که لوکوس يا مارکر ژنتيکي ناميده مي شوند، نياز است.
مارکرهاي ژنتيکي مختلف شامل کمپلکس ژني rDNA هسته ايي، ژن کيتين سنتاز 2 (Chs-2) و ژن زير واحد يک RNA پلي مراز اخيرا به منظور شناسايي گونه هاي مختلف مالاسزيا استفاده مي شوند (25و82). مطالعات زيادي نشان مي دهند که از نواحي 1ITS-1، ITS-2، 2IGS-1 و دومنهاي D (D1 و D2) و زير واحد بزرگ DNA ريبوزومي که در کمپلکس ژني rDNA قرار دارند، مي توان بعنوان مارکرهاي ژنتيکي معتبر براي شناسايي گونه هاي مالاسزيا استفاده کرد (63).
توالي يک مارکر ژنتيکي در گونه هاي مختلف يک جنس قارچي، بايد به اندازه کافي با هم فرق داشته باشند، تا بتوان از آنها براي شناسايي اختصاصي گونه ها استفاده کرد. ولي اختلافات اين مارکرها در داخل يک گونه جزئي است يا اصلا وجود ندارد. در مقابل به منظور شناسايي استرين ها، اختلاف قابل توجهي در توالي هر مارکر ژنتيکي داخل يک گونه وجود دارد.
کمپلکس ژني rDNA
کمپلکس ژني rDNA يک کمپلکس چند نسخه اي (Multi copious) است که در تمام ميکروارگانيسم ها وجود دارد. توالي هر نسخه مشابه نسخه هاي ديگر در داخل آن فرد يا گونه است. جزئيات ساختاري اين کمپلکس در گروه هاي مختلف ارگانيسم هاي يوکاريوتي ممکن است اندکي متفاوت باشد اما ساختمان تيپيک اين کمپلکس متشکل از واحدهاي تکراري (unit repeat) است که هر واحد از ژنهاي کد کننده 18S ، 5.8S و 28S و نواحي غير کد کننده فاصله انداز رونويسي1 شامل نواحي ITS و2ETS تشکيل شده است. واحدهاي تکراري، توسط نواحي فاصله انداز داخلي3 از هم جدا مي شوند (50). کمپلکس ژني rDNA داراي بخش هاي مختلف محافظت شده و متغير است که بسته به اهداف تشخيصي يا تحقيقي مي تواند براي شناسايي ميکروارگانيسم ها در حد جنس وگونه يا فوق جنس و زير گونه بکار رود. اين نواحي مارکرهاي مناسبي براي تعيين جايگاه تاکسونوميک بيشتر قارچ ها ازجمله مالاسزياها مي باشد. (16).
تعيين توالي ناحيه ITS، در مطالعات مختلف جهت شناسايي قارچ هاي مختلف از جمله درماتوفيت ها، گونه هاي کانديدا، قارچ هاي سياه، گونه هاي مالاسزيا و غيره مورد استفاده قرار گرفته است و شايد بتوان گفت هيچ مارکري در ميان قارچ ها به اندازه مارکر ITS تعيين توالي نشده است (50).
ناحيه ITS به يک قطعه DNA فاقد عملکرد نسبت داده مي شود که بين نواحي 18S و 28S در rDNA قرار دارد. درطول بلوغ rRNA ، ITS و ETS جدا مي شوند و بعنوان محصولات فرعي فاقد عملکرد به سرعت از بين مي روند. از ناحيه ITS، بعلت تنوع توالي نوکلئوتيدي بالائي که دارد، مي توان براي افتراق گونه ها و حتي تشخيص داخل گونه ايي استفاده کرد. بنابراين با مقايسه سکانس ناحيه ITS بطور وسيعي در تاکسونومي و فيلوژني قارچ ها مي توان استفاده کرد. اين امر بعلت تعداد کپي هاي زياد ژن rRNA است که در نتيجه با مقدار کم DNA هم مي توان اين ناحيه را تکثير کرد (50و51). براي مثال از ناحيه ITS-1 براي تمايز 7 گونه مالاسزيا با رنج 70-26? اختلاف در توالي نوکلئوتيدي، استفاده شد. همچنين اختلافات داخل گونه اي با رنج 8/2-7/1? اختلاف در توالي نوکلئوتيدي ناحيه ITS-1 در گونه هاي مالاسزيا فورفور، مالاسزيا سمپودياليس، مالاسزيا اسلوفيا و مالاسزيا پاکي درماتيس شناسايي شدند (51). بعد از سال 1996با استفاده از اختلاف در توالي ITS-1، گونه مالاسزيا ژاپونيکا معرفي شد(70). Makimura و همکاران درمطالعه ايي که روي گونه هاي مالاسزيا در سال 2000 بر اساس توالي ITS-1 انجام دادند، 22 ايزوله از مالاسزيا سمپودياليس را به 3 گروه تقسيم بندي کردند که 84? ايزوله ها به گروه يک تعلق داشت (63).
ژن chs-2
آناليز ژن Chs-2 نشان مي دهد که اين ژن توانايي تمايز 7 گونه مالاسزيا را دارد، با توجه به اينکه 95? شباهت در سکانس گونه ها در اين ژن وجود دارد (56). با استفاده از ژن Chs-2 در نمونه هاي باليني مالاسزيا پاکي درماتيس از گربه ها و سگها، 4 ژنوتيپ تشخيص داده شده است (A,B,C,D) که به ضايعات پوستي يا اوتيت مربوط مي شوند. اخيرا براي ژنوتيپ مالاسزيا پاکي درماتيس از آناليز توالي مولتي لوکوس(ITS-1, LSU و ژن Chs-2) استفاده شد که با استفاده از اين توالي 3 ژنوتيپ (A، B و C) براي آن تعريف شد (20). 2 تا از اين ژنوتيپ ها مربوط به ضايعات پوستي بودندکه مخمرها در اين موارد فعاليت ففوليپاز بالائي داشتند. ولي ژنوتيپ سوم از پوست افراد سالم که فعاليت فسفوليپازپائين داشتند بدست آمد (21و29). توالي مولتي لوکوس همچنين براي شناسايي و تمايز گونه هايي که با استفاده از روش هاي مورفولوژيکي وفيزيولوژيکي به سختي شناسايي مي شوند، استفاده مي شود (29و30).
هدف ا ز اين طرح تعيين گونه هاي مالاسزيا جدا شده از بيماران مبتلا به پيتريازيس ورسيکالر به کمک محيط کشت کروم آگار اصلاح شده و تاييد آن به روش PCR در شهر اهواز مي باشد.با توجه به توزيع متفاوت گونه هاي مالاسزيا در نواحي مختلف جغرافيايي وهمچنين حساسيت متفاوت گونه هاي مختلف به داروهاي ضد قارچي،با شناسايي دقيق گونه هاي مالاسزيا،درمان بيماري هاي مرتبط با آن تسهيل خواهد شد(31).
روشهاي تکثير نوکلئيک اسيد در آزمايشگاه
(Nucleic acid multiplication method in lab):
1) تکثير سيگنال
2) تکثير پروب
3) تکثير هدف: شامل تکنيک PCR است(57).
واکنش زنجيره اي پلي مراز(PCR)
پيشرفت هاي 2 دهه اخير در زمينه بيولوژي مولکولي موجب ارتقاء کارايي و تکامل هرچه بيشتر آزمايش هاي وابسته به DNA در علوم باليني گرديده است. يکي از مهمترين اين پيشرفت ها در زمينه بيولوژي مولکولي که در عين حال کاربرد تشخيصي نيز دارد، PCR مي باشد که علاوه بر سريع نمودن آزمايش هاي وابسته به DNA در موارد متعدد موجب افزايش حساسيت اين گونه آزمايش ها گرديده است. به طور کلي PCR به روش ازدياد مقادير جزئي DNA يا RNA (ازدياد RNA با روش RT-PCR امکانپذير است) تا حد مشاهده آنها توسط روش هاي ساده و رايج آزمايشگاهي اطلاق مي شود.
قابليت PCR در ازدياد اسيدهاي نوکلئيک موجود در نمونه مورد آزمايش، موجب شناسايي سريع و اختصاصي نوع سلول يا ميکروارگانيسم مورد نظر در نمونه مذکور مي گرددکه اين ويژگي علاوه بر بکارگيري PCR در تشخيص آزمايشگاهي بيماري ها،آن را بعنوان ابزاري مطمئن و حساس در زمينه پژوهش هاي علمي مطرح مي سازد. از زمان معرفي PCR در سال 1988، بکارگيري آن در تحقيقات بيولوژيکي پايه و کاربردي، موجب ايجاد تغييرات اساسي گرديده است. اين تکنيک آزمايشگاهي براي نخستين بار توسط کري موليس 2 در سال 1988 معرفي گرديد. روش PCR تنها براي توالي هايي مورد استفاده قرار مي گيرد که از قبل شناخته شده باشد. همچنين قطعات بسيار بزرگ توانايي تکثير با PCR را ندارند(72).
مواد مورد نياز جهت انجام تکنيک PCR
آنزيم DNA پلي مراز3 : براي تکثير يک قطعه DNA نياز به DNA پلي مراز است. در ابتداي طراحي PCR
از آنزيم DNA پليمراز E.coli استفاده شد ولي اين آنزيم به حرارت حساس بود، لذا پس از هر بار حرارت دادن محيط واکنش تا دماي94 درجه سانتي گراد، افزودن آنزيم تازه به محيط لازم بود. يکي از مهمترين کشفيات در اين زمينه استفاده از آنزيم Taq پليمراز بود. اين آنزيم از باکتري Termus aquaticus که يک ميکروارگانيسم آبزي در آب هاي گرم است، جداسازي شده است. اين آنزيم نسبت به حرارت مقاوم بوده و حتي در حرارت بالا فعاليت بهتري دارد. يک مزيت بسيار مهم ديگر Taq پلي مراز افزايش حساسيت و دقت PCR است. معمولا حدود 5/1-1 واحد آنزيمTaq پليمراز در يک واکنش 50 ميکروليتري استفاده مي شود. غلظت هاي بالاتر ممکن است باعث سنتز محصولات غير اختصاصي شود.
پرايمرها4 : DNA پليمراز براي شروع سنتزنياز به پرايمرها دارد. پرايمرها قطعات DNA بازسازي شده جهت تکثير از روي DNA الگو مي باشند. پرايمرها بصورت مکمل با بازهاي DNA الگو طراحي مي شوند. ايده آل آن است که پرايمرها تعداد مساوي از هر 4 باز را داشته باشند. پرايمرها در واکنش PCR در دو سوي توالي هدف متصل مي شوند و بدين ترتيب فعاليت آنزيم DNA پلي مراز شروع مي گردد. اتصال غير اختصاصي پرايمرها خصوصا در انتهاي ‘ 3 باعث توليد محصولات غير اختصاصي DNA مي شود. در طراحي پرايمرها چند عامل بايد مد نظر قرار گيرد:
– پرايمرها تعيين کننده قسمت قابل تکثير DNA باشند.
– براي هر PCR، دو پرايمر طراحي گردد.
– طول پرايمرها معمولا 30-15 نوکلئوتيد باشد.
– پرايمرها نبايد مکمل يکديگر باشند.
5dNTP:dNTP ها در واقع نقش سوبتراي آنزيم DNA پليمرازرا بر عهده دارند. وجود اين مولکول ها براي واکنش PCR بيار مهم و ارزنده مي باشد. اين مولکول ها يا بصورت مخلوط و يا حتي به اشکال جداگانه مورد استفاده قرار مي گيرند.
بافر مناسب: بافر PCR نقش مهمي در افزايش کارايي PCR و ممانعت از تجمع و اتصال مولکولهاي پروتئيني آنزيم Taq DNA پليمراز به يکديگر دارد. بافر PCR معمولا شامل تريس با PH= 8.3-8.8 و يک نمک است که معمولا، KCL, MgCL2 و يا آمونيوم سولفات است.
MgCL2: از اجزاء مهم وتاثير گذار واکنش PCR است که باعث افزايش و کارايي و بهينه کردن پرايمرها، توالي هدف، بافر و افزايش اتصال پرايمرها، جلوگيري از اتصال غير اختصاصي پرايمرها با توالي هاي غير هدف، افزايش فعاليت آنزيم Taq DNA پليمراز مي شود. يونهاي Mg?? با dNTP ها و پرايمرها و الگوي DNA تشکيل کمپلکس مي دهند. مقدار MgCL2 بستگي به پرايمر و DNA از 1 الي 10 ميلي مولار متغيراست.غلظت هاي کم MgCL2 منجر به کاهش محصولات PCR مي شود و غلظت هاي زياد آن موجب ايجاد محصولات غير اختصاصي مي گردد.
دستگاه ترموسايکلر 6: يکي از پيشرفت هاي عمده در زمينه PCR کشف دستگاه ترموسايکلر بود. ترموسايکلر در واقع بلوک هاي حرارتي قابل برنامه ريزي مي باشند که بطور اتوماتيک حرارت هاي لازم را براي مراحل سه گانه PCR توليد مي نمايد ضمن اينکه تعداد چرخه هاي مورد نياز براي انجام PCR و ازدياد DNA به طور اتوماتيک در اين دستگاه بوقوع مي پيوندد (72و57).
طراحي پرايمر
قواعد مشخصي براي اينکه بتوان يک جفت پرايمر موثر را با اطمينان انتخاب کرد وجود ندارد. در حال حاضر پرايمر بيش از هر عامل ديگري عامل موفقيت و شکست در يک واکنش PCRاست. بعضي قواعد راهنماي هاي مفيدي را در مورد طراحي آغازگر به ما ارائه مي کنند که ذيلا به آنها اشاره شده است:
– طول متوسط هر پرايمر بين 30-15 جفت باز باشد. پرايمر با طول کوچکتر اتصال غيراختصاصي را افزايش مي دهد و پرايمر بزرگتر سرعت هيبريداسيون را کم مي کند.
– مقدار C+G دو پرايمر با هم مشابه بوده و حدود 60-50? باشد.
– پرايمرها بايد از نظر مکمل بودن با هم کنترل شوند.
پرايمردايمريا آغازگردوتايي يک تکثيرمصنوعي است که اغلب در محصول PCR مشاهده مي شود وعبارت است ازيک قطعه دو رشته اي که طول آن تقريبا به مجموع دو پرايمر نزديک است وهنگامي مشاهده مي شود که يک پرايمرتوسط آنزيم پليمراز به روي پرايمر ديگرگسترش يابد. مکانيسم واقعي چگونگي تشکيل پرايمردايمربه درستي مشخص نيست. درهرحال چنانچه پرايمردايمر به عنوان مانعي مشاهده شود مي توان آن را تا حدودي با غلظت حداقل پرايمر وآنزيم کاهش داد.
– در انتهاي’ 3 پرايمر بايد حداقل C يا G قرار گيرد. در پرايمرهايي که توالي انتهاي’ 3 آنها غني از C+G است احتمال اتصال اشتباه افزايش مي يابد.
– نسبت چهار نوع نوکلئوتيد در پرايمر ها حتي المقدور يکسان باشد.
– پرايمرها به توالي تکرار شونده ختم نشوند.
– دماي Tm دو پرايمر نزديک هم باشد
– حد مجازدماي اتصال پرايمر بايد بين 65-55 درجه سانتي گراد باشد. دماي تکثيرايده آل 72-62 درجه سانتي گراد مي باشد.
درجه حرارتي که پرايمر به DNA الگو متصل مي شود به طول آغازگر و مقدار C+G آن بستگي دارد. براي پرايمرهاي حاوي 50? C+G و داراي 20 نوکلئوتيد، دماي 55 درجه سانتي گراد پيشنهاد مي شود. براي افزايش اختصاصي عمل کردن پرايمر، حتي ممکن است به دماهاي بالاتري هم نياز باشد. براي اينکه هر پرايمر به رشته الگوي خودش متصل شود لازم نيست که عينا وکاملا مکمل رشته الگو باشد. براي طراحي پرايمراغلب از برنامه هاي کامپيوتري ويژه استفاده مي شود طول قطعه مورد تکثيردر PCR نبايد بيش ازkb 3 باشد و حد مطلوب کمترازkb1 مي باشد. تکثير قطعات بسيار طويل و بالاي kb 40 است اما نياز به روشهاي ويژه اي دارد.
دماي ذوب پرايمر7
دماي اتصال بايد به قدر کافي پايين باشد تا پرايمر و DNA الگو قادر به اتصال باشند. از سوي ديگر بايد به قدر مناسب بالا باشد تا از تشکيل اتصالات غير اختصاصي جلوگيري کند. دماي اتصال از روي شاخصي به نام درجه حرارت ذوب محاسبه مي شود. دماي ذوب درجه حرارتي است که در آن نيمي از DNA به صورت تک رشته اي در آمده است. يکي از مهمترين مشخصات Tm وابستگي آن به ترکيب بازي DNA است. گوانين و سيتوزين 3 پيوند هيدروژني و بازهاي آدنين و تيمين دو پيوند هيدروژني دارند. بنابراين هر چقدر مقدار



قیمت: تومان


پاسخ دهید