دانشگاه آزاد اسلامي
واحد دامغان
دانشكده علوم زيستي
پايان‌نامه براي دريافت درجه كارشناسي ارشد در رشته زيست‌شناسي
گرايش ژنتيك
عنوان
بررسي ارتباط پيوستگي بين هموگلوبين D و انواع هاپلوتيپهاي مجموعه ژني بتاگلوبين در افراد مازندراني
استاد راهنما
دکتر محمدرضا مهدوي
استاد مشاور
دکتر رضا نظام زاده
نگارنده
فاطمه مداحيان
تابستان 93
سپاسگزاري
حمد و سپاس مخصوص خداوندي است که داشتن او جبران همه نداشته هاي من است. اينک که در پرتو عنايت باري تعالي اين تحقيق را به پايان رساندم، باشد که در سايه سار لطف او اين کار قدم کوچکي در مسير خدمت و کمک به خلقش قرار گيرد تا بتوانم رضايت او و بندگانش که هدف اصلي زندگيست را کسب کرده باشم.
ماحصل آموختههايم را تقديم ميکنم به آناني که مهر آسمانيشان آرام بخش آلام زميني است.
به سبزترين نگاه زندگيم، نگاه سبز مادرم که اميد را در سراسر زندگيم به من هديه داد.
به استوارترين تکيهگاهم، دستان پر مهر پدرم که درس جسارت و پشتکاري را در وجودم نهفت.
هرچه آموختم در مکتب عشق شما آموختم و هرچه بکوشم قطرهاي از درياي بيکران مهربانيتان را نتوان سپاس گويم. امروز هستيام به اميد شماست و فردا کليد باغ بهشتم رضاي شما
***بوسه بر دستان پرمهرتان***
جا دارد در اينجا با بيان چند عبارت ناچيز از عزيزاني که مرا در مراحل مختلف پژوهش حاضر راهنمايي و ياري فرمودهاند نيز صميمانه نهايت تشکر و قدرداني را کرده باشم.
از استاد ارجمند و گراميام جناب آقاي دکتر محمدرضا مهدوي که راهنمايي اين پايان نامه را بر عهده داشتند و با راهنماييهاي ارزشمند و بي منتشان همواره باعث دلگرمي بنده را در تمامي مراحل اجرايي و تدوين اين پايان نامه شدند.
از استاد عزيزم جناب آقاي دکتر رضا نظام زاده که مشاورهي اين پايان نامه را برعهده داشتند و با حمايتها و
پيگيريهاي بيدريغ و مستمرشان در کليه مراحل اين پايان نامه دلسوزانه بنده را ياري کردند.
و از تمام دوستان و همکاران گرانقدر که در مرکز تحقيقات تالاسمي استان مازندران
بنده را در اين راه صميمانه ياري کردند.
فهرست مطالب
عنوان صفحه
چکيده1
فصل اول: مقدمه
1ـ1 بيان مسئله:3
1ـ1ـ1 هموگلوبين3
1ـ1ـ2 ساختمان هموگلوبين3
1ـ1ـ3 بيان تکويني هموگلوبين5
1ـ1ـ4 ساختمان زنجيره گلوبين7
1ـ1ـ5 خوشه ژني آلفاگلوبين7
1ـ1ـ6 خوشه ژني بتاگلوبين8
1ـ1ـ7 ناهنجاري هاي هموگلوبين در انسان8
1ـ1ـ8 اختلالات هموگلوبينهاي انساني9
1ـ1ـ9 واريانت هاي ساختماني زنجيره گلوبين9
1ـ1ـ10 بيماري هاي سنتز زنجيره هموگلوبين12
1ـ1ـ11 تالاسمي12
1ـ1ـ12 مروري برهموگلوبينوپاتي هاي نادر گزارش شده در ايران12
1ـ1ـ13 هموگلوبين D15
1ـ1ـ14 هاپلوتيپ17
1ـ1ـ15 هاپلوتيپ هاي مجموعه ژني بتاگلوبين18
1ـ2 اهداف19
1ـ2ـ1 هدف کلي طرح:19
1ـ2ـ2 اهداف فرعي طرح:19
1ـ2ـ3 اهداف اختصاصي طرح:19
1ـ2ـ4 اهداف کاربردي طرح:20
1ـ2ـ5 فرضيههاي طرح:20
فصل دوم: مروري بر تحقيقات انجام شده
2ـ1 پيش زمينه22
2ـ2 تحقيقات و نتايج گذشته22
فصل سوم: مواد و روشها
3ـ1 مواد و روشها28
3ـ1ـ1 مواد، تجهيزات و لوازم مورد استفاده28
3ـ1ـ1ـ1 ليست دستگاهها و لوازم مورد استفاده براي اجراي اين پايان نامه در جدول 3-1 آمده است.28
3ـ1ـ1ـ2 مواد28
3ـ1ـ1ـ2ـ1 مواد مصرفي عمومي28
3ـ1ـ1ـ2ـ2 مواد مصرفي شيميايي29
3ـ1ـ1ـ2ـ3 مواد مصرفي بيولوژيک29
3ـ1ـ1ـ2ـ4 محلولها30
3ـ1ـ1ـ2ـ4ـ1 محلولهاي لازم جهت استخراج30
3ـ1ـ1ـ2ـ4ـ2 محلولهاي لازم جهت واکنش PCR30
3ـ1ـ1ـ2ـ4ـ3 محلول هاي لازم جهت الکتروفورز کردن DNA31
3ـ1ـ2 روشها:32
3ـ1ـ2ـ1 بيماران مورد مطالعه32
3ـ1ـ2ـ2 استخراج DNA ژنومي به روش نمک اشباع32
3ـ1ـ2ـ3 تعيين كميت و كيفيت DNA استخراج شده34
3ـ1ـ2ـ4 واکنش زنجيرهاي پليمراز (PCR)35
3ـ1ـ2ـ5 تهيه ژل آگارز و الكتروفورز محصولات PCR36
3ـ1ـ2ـ6 رنگ آميزي با اتيديوم برمايد و عکسبرداري از ژل37
فصل چهارم: نتايج
4ـ1 نتايج39
4ـ1ـ1 جمعيت مورد مطالعه39
4ـ1ـ2 بررسي نتايج شناسايي هموگلوبين D40
4ـ1ـ3 بررسي نتايج جايگاههاي مجموعه ژني بتاگلوبين:41
4ـ1ـ4 بررسي جهش‌ها به روش حضور و يا عدم حضور جايگاه شناسايي آنزيم محدودكننده (RFLP)43
4ـ1ـ5 بررسي هفت جايگاه درمجموعه ژني بتاگلوبين به منظورشناسايي هاپلوتيپها توسط تکنيکRFLP-PCR :44
4ـ1ـ6 آناليز دادهها45
فصل پنجم: بحث و پيشنهادات
5ـ1 بحث49
5ـ2 نتيجه گيري52
5ـ3 پيشنهادات52
فهرست منابع53
منابع فارسي:53
منابع انگليسي:53
Abstract57
فهرست جدولها
عنوان جدولها صفحه
جدول 1-1- ميزان هموگلوبين هاي انساني درطي دوران مختلف زندگي 6
جدول 1-2: واريانت هاي شايع ساختماني هموگلوبين11
جدول3-1: ليست دستگاهها و لوازم مورد استفاده27
جدول3-2: ليست مواد مصرفي عمومي28
جدول3-3: ليست موادمصرفي شيميايي28
جدول3-4: ليست مواد مصرفي بيولوژيك29
جدول3-5: غلظت اجزاي مورد استفاده براي برنامه دمايي واكنش PCR35
جدول 3-6: مراحل PCR، دما و مدت زمان آنها 35
جدول 4-1: يافته هاي هماتولوژيک بيماران با باند هموگلوبينD مراجعه کننده39
جدول 4-2: آناليزپيوستگي هاپلوتيپ ها در يک خانواده46
جدول4-3: ژنوتيپ افرادي که داراي داري هموگلوبين دي – پنجاب بوده اند46
جدول 4-4: انواع هاپلوتيپ هاي شناسايي شده با آلل هموگلوبين D وآلل نرمال 47
فهرست شکلها و تصويرها
عنوان شکل ها صفحه
شکل1-1- زنجيره هاي گلوبين ومولکول هم درهموگلوبين انساني 4
شکل1-2- بيان هشت نوع مختلف هموگلوبين درطي مراحل مختلف روياني، نوزاد ي و بلوغ ازهموگلوبين 5
شکل1-3- سازماندهي خوشه ژني آلفاگلوبين وبتاگلوبين برروي کروموزوم هاي 16 و 118
شکل 1-4- شيوع هموگلوبينوپاتي هاي گزارش شده در مناطق مختلف ايران13
شکل 1-5- شيوع هموگلوبينوپاتي هاي گزارش شده در مناطق مختلف ايران14
شکل 1-6- هموگلوبينوپاتي هاي گزارش شده درکشورهاي همسايه ايران15
شکل1-7- هاپلوتيپينگ مجموعه ژني بتاگلوبين18
شکل4-1- نتايج آزمايشات مولکولي بيماران داراي هموگلوبينD40
شکل 4-2- نتايج مربوط به RFLP-PCR با استفاده از آنزيم Hinc II 41
شکل 4-3- نتايج مربوط به RFLP-PCR با استفاده از آنزيمHind III 41
شکل 4-4- نتايج RFLP-PCR مربوط به هضم آنزيمي آنزيم Hinc II42
شکل 4-5- نتايج RFLP-PCR مربوط به هضم آنزيمي آنزيم Hinc II42
شکل 4-6- نتايج RFLP-PCR مربوط به هضم آنزيمي آنزيم Ava II43
شکل4-7 توالي پرايمرهاي مورد استفاده براي هر جايگاه45
چکيده
مقدمه: هموگلوبين دي – پنجاب يکي از انواع هموگلوبينوپاتي ها مي باشد كه در آن جهش در موقعيت 121 بر روي زنجيره بتا رخ داده است. اين اختلال هموگلوبين در هندوستان، پاكستان و ايران شايع مي باشد.افراد هتروزيگوت براي اين بيماري غالباً بدون علامت باليني خاصي مي باشند، در حالي که در حالت هتروزيگوت مرکب با هموگلوبين S افراد مبتلا، کم خوني داسي شکل را بروز مي دهند. مطالعه قبلي درشمال کشور نشان داد که تمامي واريانت هاي هموگلوبين دي درساري از نوع دي – پنجاب مي باشند ولي نوع هاپلوتيپ هاي همراه اين واريانت شناخته نشده بود. هدف از اين مطالعه شناسايي انواع هاپلوتيپ هاي همراه هموگلوبين دي در مجموعه ژني بتاگلوبين بوده است.
مواد و روشها: در بررسي حاضر تعداد 18 نفر از خانواده هاي افرادي که داراي هموگلوبين دي – پنجاب بوده اند انتخاب گرديدند و DNA ژنومي از تمامي افراد با استفاده از روش استاندارد نمک اشباع استخراج گرديد. سپس نوع هاپلوتيپ همراه هموگلوبين دي – پنجاب با استفاده از تکنيک PCR-RFLP و آناليز پيوستگي در خانواده مشخص شد.
نتيجه: مطالعه حاضر نشان داد که در 17 خانواده از 18 خانواده بررسي شده آلل هموگلوبين دي با هاپلوتيپ
– + +]- – – +[ پيوستگي دارد. و در تنها يک خانواده نيز آلل داراي هموگلوبين دي به همراه هاپلوتيپ[- + + – + + +] ديده شد.
بحث و نتيجهگيري: مطالعه ما نشان داد بخش عمده واريانت هموگلوبين دي – پنجاب در ساري داراي منشاء يگانه مي باشند و هاپلوتيپ نادر ديده شده احتمالا يا منشاء ژنتيکي متفاوتي دارد يا در اثر مکانيسم هايي از قبيل نوترکيبي ژني به وجود آمده است
کليد واژه: هموگلوبين دي-پنجاب، هاپلوتيپ، PCR-RFLP، ساري
فصل اول
مقدمه
1ـ1 بيان مسئله:
1ـ1ـ1 هموگلوبين
نام هموگلوبين از واژه هم و گلوبين گرفته شده است که هر واحد هموگلوبين داراي پروتئين گلوبولار با گروه هم است و هر گروه هم در برگيرنده يک اتم آهن است که مي تواند با يک مولکول اکسيژن از طريق نيروي دو قطبي آهن ترکيب شود ( پروتز1،1960). اين پروتئين که ناقل اکسيژن در خون است براي اولين بار توسط هانفيلد در سال 1840 کشف شد و همچنين براي اولين بار نقش هموگلوبين در خون توسط فيزيولوژيست فرانسوي کلود برنارد مشخص شد (هانفيلد21840). عمومي ترين نوع هموگلوبين در پستانداران شامل چهار زير واحد است . هموگلوبين مهمترين وفراوانترين پروتئين موجـود در گلبول هاي قرمز بوده و نقش اساسي در حمل ونقل اکسيژن ودي اکسيدکربن و پروتون دارد (پروتز،1960).
1ـ1ـ2 ساختمان هموگلوبين
مولکول هموگلوبين همانطورکه دربالا به آن اشاره شده شامل دو بخش ميباشد:
1- بخش پروتئيني موسوم به گلوبين که داراي چهار زنجيرة پلي پپتيدي مي باشد (تترامر است).
2- بخش غير پروتئيني موسوم به هِم (heme) که به آن گروه پروستتيک مولکول هموگلوبين مي گويند(جنسن3 وفرانک 2009).مولکول هِم مسئول رنگ قرمز هموگلوبين و ميوگلوبين است ويک اتم آهن دو ظرفيتي در مرکز آن قرار گرفته است. اگر اتم آهن دو ظرفيتي(Fe²+) به آهن سه ظرفيتي(Fe³+) اکسيد شود، عملکرد مولکول از بين خواهد رفت(پين وهمکاران 41985). در مولکول هِم هر اتم آهن فرو قادر است 6 پيوند کئوردينانس(داتيو) برقرار سازد. چهار عدد از اين پيوندها با اتم هاي نيتروژن موجود در حلقة پورفيرين برقرار مي شود، که همگي در يک سطح قرار دارند. پيوندهاي پنجم وششم نيز در بالا و پايين اين سطح قرار دارند. پيوند پنجم بين آهن و نيتروژن يکي از اسيدهاي آمينة گلوبين و پيوند ششم بين آهن و مولکول اکسيژن برقرار مي شود. بديهي است در صورتيکه هموگلوبين، اکسيژن خود را از دست بدهد، پيوند ششم وجود نخواهد داشت (لينبرگ 5وهمکاران،1998)( شکل 1-1). هر مولکول هِم قادر است يک مولکول اکسيژن را جابجا کند، لذا هر مولکول هموگلوبين توانايي حمل چهار مولکول اکسيژن را داراست ( لينبرگ وهمکاران،1998 ).
شکل1-1:زنجيره هاي گلوبين ومولکول هم درهموگلوبين انساني (پروتز ،1960).
1ـ1ـ3 بيان تکويني هموگلوبين
تجزيه وتحليل هموگلوبين جنين انسان مشخص کردکه اساسا هموگلوبين جنيني ازيک هموگلوبين باتفاوت حرکت الکتروفورزي نسبت به هموگلوبين طبيعي تشکيل شده است که هموگلوبين جنيني ياHbF ناميده مي شود. آناليز متعاقب نشان داد کهHbF تترامري ازدوزنجيره -? گلوبين ودوزنجيره پلي پپتيدي ديگراست که توالي آن شبيه زنجيره-? گلوبين بوده وگاما(?) ناميده مي شود.HbF حدود50 درصدازهموگلوبين خون بالغين طبيعي راتشکيل مي دهد(بوساليس6 وهمکاران ،2011).
ژن هاي گلوبين انساني در دو دوره زماني توسعه مي يابد. از دوره روياني(?) تادوره نوزادي(?) و از دوره نوزادي(?) تادوره بلوغ گلوبين مي باشد.
فعال شدن هموگلوبين جنيني(HbF) دربزرگسالان يکي ازاستراتژي هاي موثربراي درمان بيماري سلول داسي شکل وبتاتالاسمي است که به عنوان افزايش سطح هموگلوبين جنيني بابهبود علائم دربيماران مبتلابه هموگلوبينوپاتي همراه است.
درانسان سالم هشت نوع مختلف ازهموگلوبين درطي مراحل مختلف روياني،نوزادي وبلوغ بيان مي شود. (شکل 1-2) که اين نشان دهنده مدل عمده اي از زيست شناسي تکاملي است که توسط تعويض وخاموش وروشن شدن ژن هاي مختلف گلوبين بيان مي شوند(کاپيليني7 وهمکاران ،2009).
شکل1-2: بيان هشت نوع مختلف هموگلوبين درطي مراحل مختلف روياني، نوزاد ي وبلوغ ازهموگلوبين(کاپيليني ،2009).
هموگلوبين بالغين (HbA) داراي دوزنجيره آلفاگلوبين و دو زنجيره بتاگلوبين (?2 ?2) مي باشد. HbA قبل ازهفته 8 تا 10 حاملگي قابل رديابي نيست، ولي بعدازماه سوم حاملگي، 4 تا 13 درصدهموگلوبين، هموگلوبين از نوع HbA است درحاليکه هموگلوبين جنيني(HbF) داراي دوزنجيره آلفاگلوبين ودوزنجيره گاماگلوبين (?2 ?2) است. هموگلوبين جنيني ازاوايل دوره روياني قابل مشاهده است و سنتزآن به طورسريع افزايش مي يابد. بطوريکه درهفته هشتم حاملگي، حداقل 90 درصد هموگلوبين ازاين نوع مي باشد ودرطي دوران جنيني و نوزادي به شکل غالب باقي مي ماند(مانتوواني8 وهمکاران، 1988).
تغيير HbF به HbAدرهفته هاي اول زندگي اتفاق مي افتد بطوريکه مقدار HbF تا ششمين ماه پس ازتولد به حدود 3% درصدکل هموگلوبين کاهش مي يابد و پس ازيک سالگي به کمتراز 2 % مي رسد. شروع اختلالات بتاتالاسمي معمولا تا هنگام جايگزيني توليد گلوبين بتا به جاي گامايعني چند ماه پس ازتولد آشکار نمي شود )مانتوواني وهمکاران، 1988).
بررسي هموگلوبين جنيني درمراحل اوليه بارداري نشانگر وجود چند فرم مختلف هموگلوبين روياني، به نامهايHb گاورI ،Hb گاور IIپورتلند رانشان ميدادکه درزمان هاي مختلف حاملگي درمقاديرمتفاوت توليدمي شوند(نصيري، 1389). بررسي هاي بعدي نشان دادکه اين هموگلوبين هاي متفاوت که درطي تکوين به طور موقتي توليد مي شوند درحقيقت تترامرهايي ازترکيب هاي مختلف زنجيره هاي گلوبين? وشبه ? ي زتا ياشبه ? ي ? يا اپسيلون(?) هستند(نصيري9، 1389) (جدول 1-1).
جدول 1-1: ميزان هموگلوبين هاي انساني درطي دوران مختلف زندگي(نصيري ،1389).
به جز بيان موقتي زنجيره زتا دراوايل زندگي روياني، ژن زنجيره -?گلوبين درطول تکوين بيان مي شود. به طور مشابه بيان زنجيره-? گلوبين درابتداي زندگي روي مي دهد. بيان زنجيره ? درطي زندگي جنيني اتفاق ميافتد که با افزايش سطوح بيان زنجيره -? گلوبين به سمت انتهاي دوران جنيني دنبال مي شود.بيان ترتيبي اين زنجيره ها،تترامرهاي مختلف هموگلوبين رادرطول تکوين نتيجه ميدهد(نصيري، 1389).
1ـ1ـ4 ساختمان زنجيره گلوبين
تعيين توالي هاي اسيدآمينه هاي پلي پپتيدهاي گلوبين هاي مختلف دردهه 1960 توسط محققين مختلف انجام گرفت و نشان داد که زنجيره -? گلوبين، 141 و زنجيره ? 146 اسيدآمينه طول دارد. مشخص شدکه زنجيره هاي آلفا و بتا يک توالي مشابه اسيدآمينه اي دارند امابه هيچ وجه همسان نيستند. آناليزتوالي اسيدآمينه زنجيره ? نشان دادکه در 10 اسيدآمينه بازنجيره -? گلوبين فرق دارد(ودرال،2001).
زنجيره هاي آلفادرهمه هموگلوبين هاي انساني شبيه هم مي باشند. زنجيره هاي غيرآلفا شامل زنجيره هاي بتاوزنجيره هاي گاما ? وزنجيره هاي دلتا(?) مي باشد(ودرال،2001). ژن هاي گلوبين دردوخوشه ژني جداگانه سنتزمي شوندکه يکي ژن هاي آلفاگلوبين يا شبه آلفا مي باشد وديگري مجموعه ژني ژن بتاگلوبين مي باشد (ودرال10،2001).
1ـ1ـ5 خوشه ژني آلفاگلوبين
ژن هاي شبه آلفاگلوبين روي کروموزوم 16 کدمي شوند وترتيب آن روي ژن ازسمت سانترومربه سمت تلومربرروي بازوي کوتاه يابازويP درکروموزوم 16 بصورت مي باشد. خوشه ژني آلفاگلوبين يک منطقه حدودا 70 کيلوبازي را روي بازوي کوتاه کروموزم 16 روي باند P13.3 اشغال مي کند (ليچمن 11و همکاران، 2006) (شکل 1-3)
شکل1-3: سازماندهي خوشه ژني آلفاگلوبين وبتاگلوبين برروي کروموزوم هاي 16 و 11(کاپيليني ،2009).
1ـ1ـ6 خوشه ژني بتاگلوبين
خوشه ژني بتاگلوبين روي بازوي کوتاه يا بازوي Pکروموزوم 11 قراردارد. خوشه ژني بتاگلوبين شامل ژن جنيني ? دو ژن گاما ? گلوبين و ژن هاي دلتا ? وبتا گلوبين مي باشد. دو ژن گاماگلوبين به جز در کدون شماره 136 دربقيه اسيدآمينهها باهم يکسان مي باشند. بنابراين، اين دو ژن با دو نام G? که شامل گلايسين و ژن A? که داراي اسيدآمينه آلانين ميباشد و در دوران جنيني بيان ميشوند ازهمديگر متمايز ميشوند (گرير12 و همکاران،2004).
1ـ1ـ7 ناهنجاري هاي هموگلوبين در انسان
هموگلوبينوپاتي ها از بيماريهاي وراثتي شايع در دنيا مي باشند که خاورميانه نيز از آن مستثني نيست و در برخي نقاط خاورميانه بيش از 10% از جمعيت، حامل يکي از اين ژن هاي غيرطبيعي هموگلوبين هستند.
جهش ها در ژن هاي گلوبين باعث تشکيل پروتئين هاي غير طبيعي مي شوند که اصطلاحاً واريانتهاي هموگلوبين ناميده مي شوند (مخرجي13 وهمکاران، 2005). درحالت طبيعي بعد از تولد، هموگلوبين A1 داراي عملکرد طبيعي و از نظر مقدار، هموگلوبين غالب دربدن است و هموگلوبينهايي مثل A2 و F با مقادير بسيار کمتر در کنار آن وجود دارند. مجموعه اين هموگلوبينها، ميزان هموگلوبين کامل فرد را تعيين مي کنند. درحالتي که به واسطه جهش، تغييري درتوالي اسيدآمينه هاي هموگلوبين رخ دهد، اين ساختار ديگر قادر به انجام عملکردمطلوب خود نبوده و اصطلاحاً هموگلوبينوپاتي به وجود ميآيد .بسياري ازاين هموگلوبينهاي غيرطبيعي داراي ميل ترکيبي بالا با اکسيژن هستند که در حاملين خود پلي سيتمي ايجاد مي کنند(مارنگو14،2006). تاکنون 1536 نقص در ژن گلوبين شناخته شده است که بسياري ازآنها با بررسي حرکت الکتروفورتيک برروي استات سلولز (pH:8.6) وسيترات آگار (pH:6.2) شناسايي مي شوند(اولدجم،2007). در ايران هموگلوبينوپاتيهاي مختلفي گزارش شده است و در حدود 5% از جمعيت کشور حامل ژن بتاتالاسمي و 1-5/0 % ديگر حاملين انواع ديگرهموگلوبينوپاتيها هستند (ارجمندي 15و همکاران، 2005).
1ـ1ـ8 اختلالات هموگلوبينهاي انساني
اختلالات هموگلوبينهاي انساني را مي توان دردوگروه عمده تقسيم بندي کرد:
1- واريانت هاي ساختماني زنجيره گلوبين
2- بيماري هاي سنتززنجيره هاي گلوبين يا تالاسمي
1ـ1ـ9 واريانت هاي ساختماني زنجيره گلوبين
در سال 1957 اينگرام نشان داد که تفاوت بين HbSو HbA در جانشيني والين به جاي اسيد گلوتاميک در اسيدآمينه شماره 6 درزنجيره بتا گلوبين است. از آن هنگام بيش از 300 واريانت الکتروفورزي هموگلوبين شناسايي شده اند که به دليل انواع مختلف جهش در اين پروتئين ايجاد مي شوند(جدول 1-2). حدود 200 مورد از اين واريانت هاي الکتروفورزي، جانشيني هاي تک اسيدآمينه هاي حاصل ازيک جهش نقطه اي هستند. اکثريت اين ها نادر بوده و با بيماري باليني همراه نيستند اما تعداد کمي ازآنها با بيماري همراه بوده و در جمعيت هاي خاصي نسبتا شايع هستند (اينگرام16،1957)
برخي از واريانت هاي هموگلوبين بابيماري همراهند، اما بسياري ازآنها بي ضرر بوده و با عملکرد طبيعي مداخله نمي کنند و فقط در طي دوره هاي بررسي جمعيتي واريانت هاي الکتروفورزي هموگلوبين شناسايي شده اند. اما به هرحال تعدادي ازآنها به طرق مختلف باعملکرد طبيعي هموگلوبين مداخله مي کنند. اگرجهش در درون زير واحدهاي گلوبين در مجاورت پاکت هاي هم(heme) 17يا در نواحي تماس بين زنجيره ها رخ دهد ميتواند توليد يک مولکول هموگلوبين ناپايدار کند که در گلبول قرمز خون رسوب کرده و به غشاي سلولي آسيب زده و در نتيجه منجر به هموليز سلول شود. همچنين جهش ها مي توانند با عملکرد طبيعي انتقال اکسيژن يا کاهش گرايش به اکسيژن منجربه توليديک نوع هموگلوبين گردند که درشکل احياء شده پايدار مي باشد و مت هموگلوبين (Methemoglobin18)ناميده ميشود (نصيري،1389).
جدول 1-2: واريانت هاي شايع ساختماني هموگلوبين (حاجي زماني وهمکاران ،2013).
1ـ1ـ10 بيماري هاي سنتز زنجيره هموگلوبين
تالاسمي ازشايعترين بيماري هاي ارثي در انسان است و در مردمان نواحي مديترانهاي، خاورميانه، شبه قاره هند و آسياي جنوب شرقي يافت مي شود. اين ها يک گروه ناهمگون ازبيماري ها هستند و بر اساس زنجيره يا زنجيره هاي گلوبيني خاص که ميزان سنتز آنها کاهش يافته است طبقه بندي مي شوند. مانند?، ? و ? ? تالاسمي. پاتوفيزيولوژي درتمامي اشکال تالاسمي مشابه است .يک عدم تعادل زنجيره گلوبين باعث تجمع زنجيره هاي آزادگلوبين درپيش سازهاي گلبول قرمز مي شود ،که نامحلول بوده ورسوب مي کنند و باعث هموليز گلبول هاي قرمز خون ياکم خوني هموليتيک مي شوند که با هيپرپلازي جبراني مغزاستخوان دنبال مي شود(نصيري ،1389).
1ـ1ـ11 تالاسمي
عدم تعادل در نسبت زنجيره هاي آلفا وبتا زمينه فرآيندهاي پاتوفيزيولوژي درتالاسمي هاي آلفا و بتا است. زنجيره هايي که به ميزان طبيعي توليد مي شود افزايش نسبي دارد. درغياب زنجيره مکمل جهت شکل گيري تترامر، زنجيره هاي طبيعي اضافي نهايتاً درسلول رسوب نموده و با آسيب زدن به غشا موجب تخريب گلبول قرمز نابالغ مي شوند. نقص درسنتزهموگلوبين همچنين منجربه کم خوني هيپوکروـ ميکروسيتک مي شود(گياردينا19 2008).
1ـ1ـ12 مروري برهموگلوبينوپاتي هاي نادر گزارش شده در ايران
در ايران و کشورهاي همسايهي آن تاکنون هموگلوبينوپاتيهاي مختلفي گزارش شده اند که در جداول زير تمامي آنها نمايش داده شده اند (1-4، 1-5، 1-6).
شکل 1-4: شيوع هموگلوبينوپاتي هاي گزارش شده در مناطق مختلف ايران (حاجي زماني وهمکاران ،2013).
شکل 1-5: شيوع هموگلوبينوپاتي هاي گزارش شده در مناطق مختلف ايران (حاجي زماني وهمکاران ،2013).
شکل 1-6: هموگلوبينوپاتي هاي گزارش شده درکشورهاي همسايه ايران (حاجي زماني وهمکاران ،2013).
1ـ1ـ13 هموگلوبين D
هموگلوبين D نوعي ازهموگلوبينوپاتي است که درمناطق غربي هندوستان ،پاکستان وايران شايع است (مخرجي وهمکاران ،2005). Itano درسال 1951 اين اختلال هموگلوبين را در موقعيت 121 برروي زنجيره بتاشناسايي کرد که درالکتروفورز قليايي همراه با هموگلوبين S حرکت مي کند و براي تمايز آنها از يکديگر ميبايست تستهاي تاييدي انجام گردد (ايتانو20،1951). الگوي وراثتي هموگلوبينD ميتواند به يکي از چهار شکل هتروزيگوت ،هموزيگوت ،هموگلوبين D تالاسمي وهموگلوبينD هموگلوبين Sباشد. (لوکنس 21وهمکاران ،1998). تاکنون واريانت هاي متعددي ازهموگلوبين D شناسايي شده اند که از نظر نقص مولکولي با يکديگر متفاوتند اين موارد بر اساس محل پيدايش و گزارش اوليه به انواع پنجاب (Punjab22) ايران(Iran)،اگري،(Agri23) ايبادان،(Ibadan) بوشمن (Bushman24). اولدرباه Ouled Rabah25، گرانادا(Granada26) و نيث (Neath27) تفکيک شده اند( لوکنس 28وهمکاران ،1998) که از اين تعداد همو گلوبين دي – پنجاب (Punjab) و ايران (Iran) در ايران گزارش شده اند. وجود واريانت هاي فوق در وضعيت هتروزيگوت با تظاهرات باليني خاصي همراه نيست. بيماران باهموگلوبين D دروضعيت هموزيگوت ممکن است بدون علايم بوده و يا نشانه هايي نظير کم خوني هموليتيک خفيف ويژگي خفيف تا متوسط طحال را نشان دهند . نوزادان داراي هموگلوبين D هتروزيگوت / بتاتالاسمي ميتوانند بدون علايم بوده يا کم خوني هموليتيک خفيف تا متوسط داشته باشند. اين علايم معمولا درنخستين ماههاي پس از تولد بروزمي کند. زيرا ميزان هموگلوبين Fدراين زمان کاهش يافته و بيان هموگلوبين ِD افزايش مي يابد. دربيماران هموگلوبين D /بتا+ تالاسمي،کم خوني خفيف تامتوسط مشاهده مي شود و تغييري درطحال ايجاد نمي گردد .کودکان داراي هموگلوبين D/بتا 0 تالاسمي که فاقدهموگلوبينA هستند.
کم خوني با علايم وبزرگي طحال را به نمايش مي گذارند و ممکن است اختلالات باليني نسبتاً شديدي داشته باشند. ازآنجايي که انديکس هاي خوني درهموگلوبينD/بتاتالاسمي غيرطبيعي است. فقر آهن نيز ممکن است بروز نمايد. توارث همزمان هموگلوبينD به همراه هموگلوبين Sبه کم خوني داسي شکل منتهي مي شود. اين حالت مشابه توارث هموگلوبينE هموگلوبينC وهموگلوبين Oarabهمراه باهموگلوبين S است(ياوريان29 و همکاران ،2009). هموگلوبين Dپنجاب (beta121 (GH4) GLu>GLn) يک هموگلوبين غيرطبيعي است که ازجايگزيني گليسين با گلوتاميک اسيد در کدون 121 ژن بتاگلوبين به وجود مي آيد. که با نام هاي هموگلوبين D لس آنجلس، D شيکاگو، D نورث کارولينا، D پرتغال و D اوک ريج (Oak ridge30) نيز شناخته مي شود، داري شيوع 2 درصدي درمناطقي از هند و پاکستان و شيوع يک درصدي در کشورهاي غربي است (بيردولهمان 31،1956). مواردي از آن در اقوا م اروپايي و درنژاد سياه نيز گزارش شده است. اين افراد رابطه نزديکي با اقوام هندي که در گذشته مهاجرت کردند دارند. (ليونلي 32وهمکاران ،2001).
همراهي بتا تالاسمي با Hb D-punjab، براي اولين بار در يک خانواده کرد 4 نفري در ايران گزارش شد که در آن پدر ناقل هموگلوبين D-punjab، مادر مبتلا به بتا تالاسمي مينور و دو فرزند پسر خانواده هتروزيگوت مرکب D-punjab/-ta\halasemia Hb بودند)رحيمي33 وهمکاران،2006).
در مطالعهاي ذاکري نيا و همکاران عنوان شده است که در جمعيت 4 ميليوني استان فارس پس از تالاسمي،هموگلوبين D بيشترين فراواني هموگلوبين هاي غير طبيعي با فراواني 7/1% را دارد. (ذاکرنيا34 وهمکاران ،2011).مطالعات قبلي که درشمال کشور با استفاده از روش-PCR RFLP35 نشان داد که تمامي افرادي که در استان مازندران حامل واريانت پنجاب هموگلوبين D بوده اند)مهدوي 36و همکاران،2011) و ساير واريانت هاي اين هموگلوبين از قبيل هموگلوبين دي – ايران در استان يافت نشد. با اين وجود هاپلوتيپ هاي همراه هموگلوبين دي – پنجاب در استان ناشناخته بوده است. هدف از اين مطالعه آن بوده است تا به شناسايي هاپلوتيپ هاي مجموعه ژني بتا گلوبين که با هموگلوبين دي – پنجاب پيوستگي دارند بپردازد.
1ـ1ـ14 هاپلوتيپ
در ژنتيک يک هاپلوتيپ عبارت است از ترکيبي از ژن‌هاي هم‌رديف (آلل‌ها/ alleles) در مکان‌هاي مختلف روي يک کروموزوم که همراه با هم منتقل مي‌شوند. يک هاپلوتيپ ممکن است شامل يک مکان، چندين مکان، يا يک کروموزوم کامل باشد که وابسته به تعداد جفت‌گيري‌ها (recombination) که بين مجموعه‌اي از مکان‌ها رخ مي‌دهد، است( آنتوناراکيس37 وهمکاران ،1982).
به عبارت ديگر، هاپلوتيپ يک مجموعه از چند شکلي‌هاي تک نوکلئوتيدي روي يک کروموزوم از جفت کروموزومي، که به صورت آماري همبسته هستند را شامل مي شود. به نظر مي‌رسد با استفاده از اين هم ‌بستگي‌ها و شناسايي تعداد کمي از آلل‌هاي يک بلوک هاپلوتيپي، مي‌توان به صورت بدون ابهام همه مکان‌هاي چند شکلي را در آن ناحيه خاص تشخيص داد. چنين اطلاعاتي در تحقيق براي عوامل ژنتيکي بيماري‌هاي شايع بسيار ارزشمند هستند( آنتوناراکيس38 وهمکاران ،1982).
1ـ1ـ15 هاپلوتيپ هاي مجموعه ژني بتاگلوبين
در سرتاسر مجموعه ژني بتاگلوبين پلي مورفيسم هاي مختلفي قرار داردکه توسط آنزيم هاي محدودکننده خاص مي توانند برش داده شوند. ازسرتاسراين مجموعه هفت پلي مورفيسم )معمولا) براي شناسايي هاپلوتيپها برروي اين مجموعه ژني مورداستفاده قرارمي گيرد. اين هفت جايگاه عبارتنداز: جايگاه 5′-? که توسط آنزيم HIinc II برش داده مي شود. جايگاهي در ژن ?G که توسط آنزيم Hind III برش داده مي شود. جايگاه ديگر در ژن A? که توسط آنزيم Hind III برش داده مي شود. جايگاهي ديگر در ژن5′-??
که توسط آنزيم Hinc II برش داده مي شود. جايگاهي ديگردرناحيه3′-??
که توسط آنزيم Hinc II برش داده ميشود. ديگرجايگاه در ژن بتاگلوبين ‘-?5 که توسط آنزيم Ava II برش داده ميشود و درنهايت جايگاهي در ژن ‘-?3 که تحت اثر آنزيم BamH1 برش مي خورد.
در صورتيکه در يک آلل اين جايگاهها با آنزيم هاي فوق الذکربرش داده شوند به صورت (+) و در صورتيکه برش داده نشوند به صورت (-) گزارش ميشوند. ترتيب قرارگرفتن اين جايگاههاي برش تشکيل يک هاپلوتيپ خاصي را مي دهند. به عنوان مثال: هاپلوتيپ 3 ]++ – – – – +[ 5 يک هاپلوتيپ شايع در ايران ميباشد که بر روي اکثر مجموعه بتا گلوبين قرار دارد. جايگاههايي که به صورت (+) مشخص ميشوند توسط آنزيم مربوطه برش خورده اند و جايگاههاي (-) توسط آنزيم مربوط به آن جايگاه برش نخورده اند. ترتيب اين جايگاهها به همان ترتيبي است که دربالا به آن اشاره شد.
شکل1-7- هاپلوتيپينگ مجموعه ژني بتاگلوبين(يانگ جونلي،2002).
در استان مازندران شيوع انواع هموگلوبينوپاتيها بسيار بالا مي باشد. در بررسي هايي که با استفاده از تکنيک کاپيلاري الکتروفورز در آزمايشگاههاي تشخيص طبي (آزمايشگاه تشخيص طبي فجر ساري که بعنوان آزمايشگاه مرجع در مازندران شناخته مي شود) صورت پذيرفته است بسياري از انواع هموگلوبين با توجه به حرکت متفاوتي که در ستون الکتروفورز دارند که منجر به ايجاد پيک هاي متفاوت مي شود قابل شناسايي هستند. در طي چندين سال و از بين مراجعين به آزمايشگاه حدود 50 فرد داراي هموگلوبين دي شناسايي شدند. با بررسي هاپلوتيپ هاي همراه يک نقص هموگلوبيني ومقايسه آن با سايرهاپلوتيپ هاي مشاهده شده همراه با اين نقص در سايرجمعيت ها مي توان به منشا بروز نقص در هموگلوبين پي برد. درمطالعه ما نيزهدف اين بود تا بابررسي هاپلوتيپ هاي همراه هموگلوبين Dبه منشاگسترش اين جهش پي ببريم.
1ـ2 اهداف
1ـ2ـ1 هدف کلي طرح:
بررسي ارتباط پيوستگي بين هموگلوبين D و انواع هاپلوتيپهاي مجموعه ژني بتاگلوبين در افراد مازندراني
1ـ2ـ2 اهداف فرعي طرح:
تعيين هاپلوتيپ هاي غالب مجموعه ژني بتا گلوبين در افراد داراي Hb D (مورد) و افراد نرمال (کنترل) مراجعه کننده به مرکز تحقيقات تالاسمي
1ـ2ـ3 اهداف اختصاصي طرح:
شناسايي افراد داراي Hb D و افراد کنترل
تعيين انواع هاپلوتيپ ها ي مختلف مجموعه ژني بتا گلوبين در افراد داراي Hb D و افراد شاهد با استفاده از آناليز پيوستگي در افراد خانواده
بررسي وجود ارتياط بين هاپلوتيپ هاي خاص
1ـ2ـ4 اهداف کاربردي طرح:
تا كنون بررسي ارتباط پيوستگي بين HbD وانواع هاپلوتيپ هاي ژني بتا گلوبين دراستان مازندران انجام نشده است.بديهي است با انجام اين طرح در بررسي بهتر فنوتيپ هاي بيماري هاي ذي ربط و بررسي اپيدميولوژيك كمك شاياني خواهد نمود.
1ـ2ـ5 فرضيههاي طرح:
بين موتاسيون Hb D و انواع متفاوت هاپلوتيپ ها پيوستگي وجود دارد.
فصل دوم
مروري بر تحقيقات انجام شده
2ـ1 پيش زمينه
مطالعات مختلفي تاکنون درخارج و داخل کشوردرخصوص ارتباط پيوستگي بين هموگلوبينD و انواع هاپلوتيپ هاي مجموعه ژني بتاگلوبين به عمل آمده است. به تعدادي ازاين مطالعات اشاره مي کنيم.
2ـ2 تحقيقات و نتايج گذشته
1ـ در مطالعهاي که در کشور ترکيه توسط ?ztürkOnur 39وهمکارانش (2007) با هدف مطالعه شناسايي هاپلوتايپ هاي ژن بتاگلوبين درافراد با موتاسيون هاي مختلف در نقاط مختلف ترکيه توسط تکنيک PCR برروي 33 نمونه DNAبه دست آمده در برنامه غربالگري قبل از ازدواج انجام شد که نمونه ها داراي جهش درژنHbs بودند. بوده است.آنها نشان دادند که 12 نفرازاين افراد که داراي موتاسيون Hbsبودند که هيچ نسبت فاميلي نداشتند. همچنين در اين مطالعه هاپلوتايپ افرادي که داراي موتاسيون هاي ديگر غير از HbS بودند نيز نشان داد که 3 نمونه داراي موتاسيون HbD-Punjab و 4 نمونه داراي موتاسيون HbJايران و 4 نمونه داراي موتاسيون HbE و3 نمونه داراي موتاسيون HbE-Saskatoon و4 نمونه هم داراي موتاسيون HbG-Coushatta بودند.تمام اين نمونه ها نسبت به موتاسيون هاي خود هتروزيگوت بودند. هموگلوبين هاي غيرطبيعي مورد مطالعه در اين مقاله ازنقاط مختلف ترکيه انتخاب شدند(اونورو40همکاران ،2007).
2ـ در مطالعهي ديگري توسطAnzel Bahad?r, وهمکاران (2009) دردپارتمان بيوفيزيک درترکيه با هدف شناسايي هاپلوتايپ هاي خوشه ژني بتا_گلوبين دربيماران بتاتالاسمي ترکيه توسط تکنيک RFLP-PCR بر روي 94 نفر دراستان دنيزلي صورت پذيرفت، آنها اظهار داشتند که 22 نفري که داراي تالاسمي ماژور بودند و همچنين 72 نفرازافراديکه سالم بودند هيچ نسبتي خويشاوندي با هم نداشتند. آنها جهش هايي را که در افراد مورد مطالعه يافتند را بصورت زير نيز گزارش کردند(انزل41 وهمکاران ، 2009).
IVSI-110 (G>A), FSC8/9(+G), IVSII-1(G>A) ,IVSI-5 (G>C), IVSI-1(G>A), IVSI- 6 (T>C), and FSC8 (-AA).
3ـ درپژوهش ديگري که توسط Anju Gupta و همکاران (2008) بر روي 64 خانواده هندي توسط تکنيک RFLP-PCR با هدف بررسي موتاسيون هاي ژن بتاگلوبين درهند و پيوستگي آنها با هاپلوتايپ هاي بتا انجام گرفت. در اين مطالعه بعد از بررسي خون و تعيين ميزان HbA2توسط ستون کروماتوگرافي ازDNAي آنها، 5 نمونه با موتاسيون شايع و 5 نمونه که موتاسيوني باشيوع کمتري داشتند و 5 نمونه با موتاسيون نادر را انتخاب کردند.
نتايج بدين صورت گزارش شده است که 5 موتاسيون درجمعيت آسيايي_هندي به عنوان جهش غالب مي باشد (IVS1-5(G-C), IVS1-1(G-T), CD8/9(+G), CD41/42(-CTTT) and -619bp) که 70 % موتاسيون ها را تشکيل مي دادند. دراين ميان IVSI-5 (G-C) با 58%شايعترين و بيشترين فراواني را دارد. درمجموع 19 هاپلوتايپ برروي کروموزم بتاتالاسمي يافت شد. آنها دراين مطالعه همچنين مشخص کردند که موتاسيون IVSI-5 به تنهايي 58% درصد از موتاسيونهاي جوامع اندونزيايي ومالزيايي را نيز شامل مي باشد ولي درجوامع چيني وتايلند شيوع کمتري دارد. (انجوگاپتا42وهمکاران، 2008).
4ـ آتالاي و همکاران نيز در سال 2007 پس از بررسي هاپلوتيپ هاي مختلف مجموعه ژني بتا گلوبين با HbD به ارتباط بين موتاسين Hb D و هاپلوتيپ [? + ?? + + +] پي بردند که تا کنون در جمعيت مديترانه اي گزارش نشده بود و در پايان مشخص شد که موتاسيونHb D Los Angeles در جمعيت مديترانه اي حدا قل سه منشاء متفاوت دارد. (آتالاي43 وهمکاران،2007).
5ـ در مطالعه ديگري که در کشور هندوستان و در شرق اين کشور صورت پذيرفت هاپلوتيپ هاي مجموعه ژني بتا گلوبين که به همراه آلل داراي هموگلوبين دي – پنجاب به ارث مي رسيدند مورد بررسي قرار گرفتند. در بررسي هاي صورت گرفته بر روي 11 خانواده غير خويشاوند مشخص شد که در 9 خانواده (0/76 %) آلل داراي موتاسيون ايجاد کننده هموگلوبين دي – پنجاب به همراه هاپلوتيپ شايع [+ – – – – + +] به ارث مي رسد و در دو خانواده ديگر (0/24 %) آلل مربوطه با هاپلوتيپ [- – – – – + +] همراه است که براي اولين بار پيوستگي اين چنيني گزارش شده است. (پاتل44 وهمکاران ،2010).
6ـ مطالعهاي توسط فوکاروئن و همکارانش در سال 2002 در خصوص بررسي مولکولي HbD پنجاب بر روي 9 بيمار توسط تکنيک PCR در کشور تايلند صورت گرفت. آنها در اين مطالعه 9 بيمار از5 خانواده غيرخويشاوند انتخاب کردند که4 نفرناقل HbD پنجاب هتروزيگوت بودندو2 نفرداراي هتروزيگوت مرکب براي HbD پنجاب و بتا تالاسمي بودند،2 بيمار ديگر هتروزيگوت دوگانه براي HbD پنجاب وجهشهاي آلفا تالاسمي بودند و 1بيمار نيز هتروزيگوت مرکب وHbD پنجاب و HbE بودند. بررسي مولکولي با استفاده ازتعيين مولکولي نشان داد که جهش HbD پنجاب [beta121(GH4)Glu–>Gln] درافرادي که ناقل بتا تالاسمي بودند برروي آلل بتاتالاسمي درجايگاه -28 (A–>G) ژن بتاگلوبين وجود داشت.
آناليزهاپلوتيپ هانشان دادکه HbD باهاپلوتيپ ]+++- ++ – [پيوستگي دارد. اين هاپلوتيپ همراه با HbD در جمعيتهاي ديگرگزارش نشده است. اين مطالعه نشان داده است که احتمالا HbD مي تواندبه طور مستقل در اين ناحيه به وجودآمده باشد.(فوچاروئن45 وهمکاران ،2002).
7ـ درمطالعه ديگري که توسط فيورتي وهمکارانش درسال 1993 درايتاليا با عنوان بررسي پيوستگي هاپلوتيپ ها در افراد داراي HbD توسط تکنيک RFLP-PCR و روش تعيين توالي در لس انجلس پرداختند. آن ها دراين مطالعه به بررسي 6 خانوادهي غيرخويشاوند در جنوب ايتاليا پرداختند که از 10 بيمارمورد مطالعه 8 فرد هتروزيگوت براي HbD پنجاب بودند و2 فرد نيزهتروزيگوت مرکب براي جهش HbD پنجاب وجهش کدون (C–>T) 39 که در ژن بتا است بودند. براي شناسايي موتاسيون هاي ژن بتاگلوبين از روش تعيين توالي استفاده شد و براي تعيين هاپلوتيپها نيزازروش PCR وRFLP استفاده شد. اين مطالعه نشان دادکه HbD پنجاب درجنوب ايتاليا با 5′ subhaplotype [+ – – – -] و با framework 1 ژن بتاگلوبين پيوستگي داشته و اين هاپلوتيپها درناحيه مديترانه اي شايع ميباشند. اين نتايج نشان مي دهدکه HbD پنجاب يا به طور مستقل درمنطقه ي مديترانه به وجودآمده است و يا در آسيا بوجود آمده و به ايتاليا راه يافته است (فيوروتي46 وهمکاران،1993).
8ـ در پژوهشي توسط ياوريان و همکارانش در سال 2009 بر روي 43 نفر از بيماران داراي هموگلوبين D از مناطق جنوب ايران ( استان هاي فارس و هرمزگان) و 13 نفر از بيماران داراي هموگلوبين D از کشورهاي بلژيک و هلند توسط روش RFLP-PCR انجام پذيرفت. تمامي افراد انتخابي به لحاظ وجود هموگلوبين D به روش الکتروفورز آلکالين سلولز استات و HPLC چک شدند و با استفاده از روش RFLP-PCR موتاسيون مربوطه در آنان شناسايي شد. سپس هاپلوتيپ هاي مجموعه ژني بتا گلوبين با کمک نمونه هاي خون خانواده مبتلايان و با استفاده از روش RFLP-PCR براي 7 جايگاه شناسايي شدند که نتايج حاصل نشان داد که چهار نوع هاپلوتيپ به همراه HbD در خانواده هاي ايراني موجود مي باشند که عبارتند از:
haplotype I [+ – – – -,+ +] (67.5%)، subhaplotype I’ [+ – – – -,- +] (17.5%)، haplotype V [- + – – +,+ +] (10%) و haplotype III [- + – + +,+ +] (5%) در حالي که در تمامي ارو پاييانHbD به همراه haplotype I [+ – – – -,+ +] بوده است که رايجترين هاپلوتيپ در اروپاست (ياوريان وهمکاران ،2009).
9ـ در مطالعهاي که رحيمي و همکارانش در سال 2006 در غرب ايران بر روي 32 نفر با عنوان بررسي ارتباط بين Hb D- Punjab و هاپلوتيپ هاي متفاوت مجموعه ژني بتا گلوبين پرداختند. در اين تحقيق تعداد 32 نفر افراد داراي Hb D که متعلق به خانواده هاي متفاوت بودند و در استان هاي کرمانشاه، ايلام و کردستان زندگي مي کردند انتخاب شدند که در آنان الکتروفورز هموگلوبين بر روي سلولز استات انجام گرفت و موتاسيون مربوطه نيز در آنان شناسايي شد. سپس هاپلوتيپ هاي متفاوت مجموعه ژني بتا گلوبين با کمک خانواده هاي افراد در تمامي افراد شناسايي شدند و با هاپلوتيپ هاي افراد نرمال در همان جمعيت مقايسه شدند. در نهايت مشخص شد که در تمامي افراد موتاسيون Hb D با haplotype I [+ – – – -,+ +] پيوستگي دارد در حالي که اين هاپلوتيپ در 42.9% ازآلل هاي افراد نرمال وجود داشت که نشان مي دهد اين موتاسيون مي تواند به طور مستقل در منطقه ايجاد شده باشد و يا در اثر ادغام با ساير جمعيت هاي آسيايي به اين منطقه وارد شده است(رحيمي وهمکاران ،2006).
10ـ رحيمي و همکارانش در سال 2005 بر روي 150 فرد تالاسمي مينور و 52 فرد سالم در استان فارس در خصوص بررسي انواع مختلف هاپلوتيپ هاي مجموعه ژني بتا گلوبين توسط روش PCR پرداختند که haplotype I [+ – – – -,+ +] در اکثر افراد چه مينور و چه سالم وجود داشته است. از 26 بيماري که براي انواع مختلف هاپلوتيپ ها هوموزيگوت بوده اند 12 نفر داراي haplotype I [+ – – – -,+ +] . فراواني haplotype I در جمعيت نرمال که رايج ترين هاپلوتيپ نيز مي باشد برابر 43% بوده است. فراوان ترين موتاسيون در بين مبتلايان نيز موتاسيون IVS II.1 (G_A) بوده که با هاپلوتيپ مشخصي پيوستگي واضحي نداشته است ولي موتاسيون IVS I.110 (G_A) با haplotype I و موتاسيون codon 30 (G_A) با haplotype V پيوستگي نشان داده اند. (رحيمي وهمکاران، 2005).
11ـ درمطالعهي تحقيقاتي که توسط ذاكري نيا وهمکارانش صورت پذيرفت آنها نشان



قیمت: تومان


پاسخ دهید