دانشکده علوم
پايان نامهي کارشناسي ارشد در رشتهي
زيست شناسي سلولي – مولکولي
بررسي ارتباط چند شکليهاي ژنتيکي GPX1 pro198leu و SOD1 A251G با خطر رد حاد پيوند کليه
به کوشش:
شيما رعيت‌پيشه
استاد راهنما:
دکتر ايرج سعادت

شهريور1393
به نام خدا
اظهار نامه
اينجانب شيما رعيتپيشه (9133360) دانشجوي رشته‌ي زيستشناسي گرايش سلولي و مولکولي دانشکده‌ي علوم اظهار مي‌کنم که اين پايان‌نامه حاصل پژوهش خودم بوده و در جاهايي که از منابع ديگران استفاده کرده‌ام، نشاني دقيق و مشخصات کامل آن را نوشته‌ام. همچنين اظهار مي‌کنم که تحقيق و موضوع پايان‌نامه‌ام تکراري نيست و تعهد مي‌نمايم که بدون مجوز دانشگاه دستاوردهاي آن را منتشر ننموده و يا در اختيار غير قرار ندهم. کليه‌ي حقوق اين اثر مطابق با آيين نامه مالکيت فکري و معنوي متعلق به دانشگاه شيراز است.
نام و نام خانوادگي: شيما رعيت پيشه
امضا و تاريخ
تقديم به:
مادر و پدر مهربانم
و
خواهران عزيزم
سپاسگزاري
ستايش خداي را سزاست که به يد قدرت بي منتهايش درياي آفرينش را جاري کرد و به اراده ازلياش همه خلق را صورت بخشيد. سپاسگزار کساني هستم که سرآغاز تولد من هستند. مادرم، مهرباني که زيستن را از او آموختم و پدرم، استوارترين تکيهگاهم.
مراتب قدرداني خود را نسبت به زحمات بيدريغ استاد راهنماي ارجمندم جناب آقاي دکتر ايرج سعادت و اساتيد مشاور آقايان دکتر مصطفي سعادت و دکتر محمدحسين کريمي به پاس کمکها و رهنمودهاي سازندهشان در انجام اين پژوهش ابراز ميدارم.
اميد دارم که تهيه و تدوين پاياننامه حاضر پاسخگوي بخشي کوچک از محبتها و زحمات آنان باشد.
چکيده
بررسي ارتباط چند شکليهاي ژنتيکي GPX1 pro198leu و SOD1 A251G
با خطر رد حاد پيوند کليه
به کوشش:
شيما رعيتپيشه
پيوند کليه راهکار درماني براي بيماران مبتلا به مرحله نهايي بيماري کليوي است. با وجود افزايش و پيشرفت چشمگير اين روند درماني، هنوز به دليل پاسخ ايمني فرد گيرنده در برابر بافت دهنده، رد پيوند شايع و عامل اصلي عدم موفقيت اين روش است. کليه پيوندي مستعد قرار گرفتن در معرض رد حاد به دلايل متفاوت از جمله استرسهاي اکسيداتيو است. استرس اکسيداتيو با تاثير منفي بر عمر و عملکرد بافت پيوندي ميتواند نهايتا منجر به رد پيوند گردد. آنزيمهاي GPX1 و SOD1 از جمله آنزيمهاي آنتياکسيدان هستند. هدف از اين پژوهش بررسي ارتباط چندشکليهاي GPX1 pro198leu (rs1050450) وA251G SOD1(rs2070424) با رد حاد پيوند کليه است. در اين مطالعه 262 بيمار دريافت کننده پيوند کليه که 46 نفر از آنها داراي رد حاد بودند و 262 فرد سالم به عنوان کنترل مورد بررسي قرار گرفتند. تعيين ژنوتيپها با روش PCR-RFLP انجام و دادهها توسط نرمافراز آماري SPSS تحليل شدند. پس از بررسي فراواني آللي و ژنوتيپي در چندشکلي pro198leu GPX1 بين دو گروه بيمار و کنترل و همچنين بيماران داراي رد حاد و فاقد رد حاد پيوند کليه تفاوت معناداري مشاهده نشد. به عبارت ديگر فراواني آللي و ژنوتيپي ژن GPX1 در چندشکلي ياد شده در بروز بيماريهاي کليوي منجر به پيوند و همچنين رد حاد پيوند کليه نقشي ندارد. در بررسي چندشکلي A251G از ژن SOD1 نيز اختلاف معناداري ميان دو گروه شاهد و بيمار و داراي رد پيوند و فاقد رد حاد پيوند مشاهده نشد. نتايج نشان ميدهند که چندشکلي SOD1 A251G در ابتلا به بيماريهاي منجر به پيوند کليه و همينطور رد حاد پيوند دخيل نيست.
واژگان کليدي: پيوند کليه، رد حاد، استرس اکسيداتيو، GPX1، SOD1
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول: مقدمه
1-1- پيوندکليه ……………………………………………………………………………………………………………….21-2- رد پيوند …………………………………………………………………………………………………………………3 1-2-1- رد فوق حاد ………………………………………………………………………………………………………3 1-2-2- رد حاد ……………………………………………………………………………………………………………..4 1-2-3- رد مزمن ……………………………………………………………………………………………………………41-3- پيشگيري از رد آلوگرافت ………………………………………………………………………………………51-4- استرس اکسيداتيو ………………………………………………………………………………………………….71-5- گلوتاتيون پراکسيداز 1 (GPX1) …………………………………………………………………………..81-6- سوپراکسيددسموتاز1 (SOD1) …………………………………………………………………………….91-7- هدف ………………………………………………………………………………………………………………………111-8- فرضيه …………………………………………………………………………………………………………………….11
فصل دوم: مروري بر تحقيقات انجام شده
2-1- مطالعات انجام شده بر روي چند شکلي GPX1 pro198leu و ارتباط آن با بيماريهاي گوناگون ……………………………………………………………………………………………………………
132-2- مطالعات انجام شده بر روي چند شکلي SOD1 A251G و ارتباط آن با بيماري هاي گوناگون………………………………………………………………………………………………………………………..
142-3- مطالعات انجام شده بر روي رد حاد پيوند کليه ……………………………………………………….. 15
فصل سوم: مواد و روش انجام کار
3-1- نمونهگيري ………………………………………………………………………………………………………………… 183-2- وسايل مورد استفاده ………………………………………………………………………………………………….193-3- مواد مورد استفاده ……………………………………………………………………………………………………..19 3-3-1- محلولهاي لازم جهت استخراج ………………………………………………………………………19 3-3-2- مواد استفاده شده جهت انجام PCR ……………………………………………………………….20 3-3-3- مواد استفاده شده جهت انجام الکتروفورز ………………………………………………………..20 3-3-4- مواد استفاده شده جهت اثر دادن آنزيم محدود کننده ………………………………….. 203-4- استخراج DNA به روش جوشاندن (Boiling) ………………………………….. ……………….21 3-4-1- ساخت محلولهاي مورد نياز جهت استخراج …………………………………………………..21 3-4-2- فرآيند استخراج به روش جوشاندن ………………………………………………………………….213-5- تعيين ژنوتيپ با روش PCR-RFLP ………………………………………………………………………21 3-5-1- PCR …………………………………………………………………………………………………………………21 3-5-2- پرايمرهاي مورد استفاده …………………………………………………………………………………..223-6- تعيين ژنوتيپ براي چند شکلي GPX1pro198leu ………………………………………………..233-7- تعيين ژنوتيپ براي چند شکلي SOD1A251G ……………………………………………………..243-8- الکتروفورز ………………………………………………………………………………………………………………….253-9- رنگآميزي ژل …………………………………………………………………………………………………………..263-10- تحليل آماري …………………………………………………………………………………………………………..27
فصل چهارم: نتايج
4-1- مشخصات افراد شرکت کننده در اين پژوهش …………………………………………………………294-2- بررسي عوامل خطر دخيل در رد حاد پيوند کليه …………………………………………………… 294-3- بررسي چند شکلي ژن GPX1 pro198leu درافراد سالم و بيماران ……………………….314-4- بررسي چند شکلي ژن GPX1 pro198leu در بيماران داراي رد حاد و فاقد رد حاد پيوند کليه ……………………………………………………………………………………………………………………
334-5- بررسي چند شکلي ژن SOD1 A251G درافراد سالم و بيماران …………………………….. 36
4-6- بررسي چند شکلي ژن SOD1 A252G در بيماران داراي رد حاد و فاقد رد حاد پيوند کليه ……………………………………………………………………………………………………………………………
384-7- بررسي همزمان اثر چند شکليهاي GPX1 pro198leu و SOD1 A251G ………….
40فصل پنجم: بحث و نتيجهگيري
5-1- بحث و نتيجهگيري ……………………………………………………………………………………………………. 435-2- پيشنهادات ………………………………………………………………………………………………………………….47
فهرست منابع …………………………………………………………………………………………………………………….48
فهرست جدولها
عنوان صفحه
جدول3-1: مشخصات افراد مورد مطالعه ……………………………………………………………………………..18جدول 3-2: مواد مورد نياز براي انجام PCR ……………………………………………………………………….22جدول3-3: برنامه تنظيم شده PCR براي تکثير ژن GPX1 در 26 سيکل ……………………….23جدول3-4: قطعات حاصل از هضم آنزيمي براي ژنوتيپ هاي چندشکلي ژنتيکي GPX1pro198leu ………………………………………………………………………………………………………………..
24جدول3-5: برنامه تنظيم شده PCR براي تکثير ژن SOD1 در 30 سيکل ……………………….24جدول3-6: قطعات حاصل از هضم آنزيمي براي ژنوتيپ هاي چندشکلي ژنتيکي SOD1A251G ……………………………………………………………………………………………………………………..
25جدول 4-1: رابطه جنسيت و رد حاد پيوند …………………………………………………………………………30جدول 4-2: رابطه گروه خوني، RH و رد حاد پيوند ……………………………………………………………30جدول 4-3: ارتباط سن در رد پيوند کليه ………………………………………………………………………….31جدول 4-4: فراواني ژنوتيپي و آللي چند شکلي ژن GPX1 pro198leu درافراد سالم و بيمار ………………………………………………………………………………………………………………………………………
32جدول 4-5: آناليز توزيع فراواني هاي ژنوتيپي و آللي ژن GPX1 بين گروه سالم و بيماران پيوند کليه ………………………………………………………………………………………………………………..
32جدول 4-6: فراواني ژنوتيپي و آللي چند شکلي ژن GPX1 pro198leu درافراد فاقد وداراي رد حاد ……………………………………………………………………………………………………………………….
33جدول 4-7: آناليز توزيع فراواني هاي ژنوتيپي و آللي ژن GPX1 در بين گروه داراي رد حاد و فاقد رد حاد …………………………………………………………………………………………………………………
34جدول 4-8: رابطه منبع بافتي جسد و رد حاد پيوند براي ژن GPX1 …………………………….. 35جدول 4-9: فراواني ژنوتيپي و آللي چند شکلي ژن SOD1 A252Gدرافراد سالم و بيمار ..36
جدول 4- 10: آناليز توزيع فراواني هاي ژنوتيپي و آللي ژن SOD1 در بين گروه سالم و بيماران پيوند کليه ………………………………………………………………………………………………………………..
37جدول 4-11: فراواني ژنوتيپي و آللي چند شکلي ژن SOD1 A252Gدرافراد داراي رد حاد و فاقد رد حاد …………………………………………………………………………………………………………………
38جدول 4- 12: آناليز توزيع فراواني هاي ژنوتيپي و آللي ژن SOD1 در بين گروه دارا و فاقد رد حاد …………………………………………………………………………………………………………………………..
39جدول 4-13: رابطه منبع بافتي جسد و رد حاد پيوند براي ژن SOD1 ……………………………40جدول 4-14: اثر همزمان چند شکليهايGPX1 و SOD1 در افراد سالم و بيمار ………….41جدول 4-15: اثر همزمان چند شکليهايGPX1 و SOD1 در بيماران دارا و فاقد رد حاد ………………………………………………………………………………………………………………………………………..
41جدول5-1: فراواني آللT در جمعيتهاي متفاوت ……………………………………………………………….45جدول5-2: فراواني آلل G در جمعيتهاي متفاوت …………………………………………………………….46
فهرست شکلها
عنوان صفحه
شکل 1-1- ساختار ژنتيکي گلوتاتيونپراکسيداز يک و چند شکلي ژنتيکي GPX1pro198leu ………………………………………………………………………………………………………………
9شکل 1-2- ساختار ژنتيکي سوپراکسيد دسموتاز يک و چندشکلي SOD1 A251G 10شکل 3-1:نتايج حاصل از PCR -RFLPچند شکلي ژنتيکي GPX1قابل مشاهده بر روي ژل آگاروز ……………………………………………………………………………………………………………………………..
26شکل 3-2:نتايج حاصل از PCR -RFLPچند شکلي ژنتيکي SOD1قابل مشاهده بر روي ژل آگاروز ……………………………………………………………………………………………………………………………..
27

فصل اول

مقدمه

1-1- پيوند کليه
پيوند به معني جابهجا کردن سلولها، بافتها يا اندامهاي انساني از يک فرد اهداکننده به يک فرد گيرنده با هدف بازگرداندن عملکرد يا عملکردهايي به بدن است. به مجموع اين سلولها، بافتها و اندامها، پيوند يا گرافت1 گفته ميشود، که انواع متفاوتي دارد. پيوند از يک فرد به خودش پيوند اتولوگ2، بين افرادي يکسان از نظر ژنتيکي پيوند همژن3، بين دو فرد از يک گونه پيوند آلوژن4 و بين افرادي از گونههاي متفاوت پيوند زنوژن5 گفته ميشود (Abbas et al, 2011).
استفاده از روش درماني پيوند اعضا براي بيماريهاي انساني در نيمقرن گذشته افزايش قابل توجهي داشته است. از ميان اندامها قلب، کليه، کبد، ريه، پانکراس، روده و تيموس و از ميان بافتها استخوان، تاندونها، قرنيه، پوست، دريچههاي قلبي، اعصاب و عروق قابل پيوند زدن هستند. به ترتيب کليه، کبد و قلب معمولترين اندامهاي پيوندي در جهان به شمار ميروند. در حال حاضر پيوند کليه، قلب، ريه، کبد، پانکراس و مغز استخوان به طور وسيعي در ايران انجام ميشود.
پيوند کليه به عنوان يک استراتژي درماني موثر براي بيماران مبتلا به مرحله نهايي بيماري کليوي يا ESRD 6 شناخته ميشود. ESRD يکي از مشکلات بهداشت عمومي در سراسر جهان است که شيوع و بروز آن در کشورهاي توسعه يافته و در حال توسعه در حال افزايش است. در اين بيماري ميزان فيلتراسيون گلومرولي کليه به کمتر از ml/min 15 ميرسد ( Mousavi et al, 2014 ).
تا سال 1389 جمعيت بيماران دچار نارسايي کليه در ايران 320 هزار نفر بودهاست که از اين ميان 49% از روش درماني پيوند کليه، 48% از روش دياليز خوني و 3% از روش دياليز صفاقي استفاده کردهاند (Aghighi et al, 2008). تا سال 1390، 31949 مورد پيوند کليه در ايران انجام گرفتهاست. ميزان بقاء يك ساله پيوند كليه در ايران نزديک به 7/94 درصد گـزارش شـدهاسـت (Almasi Hashiani et al, 2011). اولين پيوند کليه در ايران در سال 1347 در بيمارستان نمازي شيراز توسط دکتر سناديزاده انجام شد.

1-2- رد پيوند
اصليترين علت عدم موفقيت در پيوند، پاسخ سيستم ايمني فرد گيرنده در برابر بافت اهداشده است. چنانچه گيرنده آلوگرافت کليه، داراي سيستم ايمني کاملا سالمي باشد، عمل پيوند تقريبا در تمامي موارد منجر به نوعي از رد ميشود. رد پيوند پرسهاي با مکانيسمهاي متفاوت است. آنتيباديها، سيستم کمپلمان، سلولهاي T و ساير انواع سلولي در رد پيوند دخيل هستند ( et al, 2011 Gavela Mart?nez). آلوآنتيژنها هر دو دسته پاسخهاي ايمني با واسطه سلولي و همورال را برميانگيزند. با توجه به پيشينه رد پيوندهاي کليوي، الگوي هيستوپاتولوژيک رد پيوند را به سه دسته فوق حاد، حاد و مزمن طبقه بندي ميکنند (Abbas et al, 2011).
1-2-1-رد فوق حاد
اين شکل از رد پيوند در فاصله زماني کوتاهي بين چند دقيقه تا چند ساعت بعد از پيوند با واسطه سيستم ايمني هومورال اتفاق ميافتد. در اين شرايط تورم، ترومبوز عروقي، خونريزي و انفارکتوس در گرافت ديده ميشود. اين واکنشها از فعاليت آنتيباديهاي سيستم کمپلمان و سلولهاي اندوتليال گرافت ناشي شده و سرانجام باعث از دست رفتن بافت پيوندي ميشوند (Al-rabia, 2009).

1-2-2-رد حاد
سلولهاي T و آنتي باديها معمولا پس از اولين هفته پيوند، باعث ايجاد نوعي آسيب عروقي و پارانشيمي ميشوند که رد حاد نام ميگيرد. مطالعات در سويههاي خالص موش نقش محوري مولکولهاي کمک تحريکي و کموکاينها را در رد حاد پيوند نشان داده است. برخي از واسطههاي التهابي به عنوان مثال، IFN? ميتوانند حساسيت پيوند به آسيب را تغيير دهند (Cornell et al, 2008). از انواع مهم رد حاد پيوند ميتوان به رد حاد با واسطه آنتيباديها و رد حاد با واسطه سلولهاي T اشاره کرد.
رد حاد با واسطه آنتيبادي اغلب از چند روز تا چند هفته پس از پيوند آغاز ميشود. اولين نشانه در اين نوع از رد پيوند اختلال سريع در عملکرد گرافت ناشي از التهاب است. با عملکرد آنتيباديهايي که از قبل در بدن وجود دارند، فعاليت سيستم کمپلمان بر عليه گرافت آغاز ميشود. هدف اصلي اين آنتيباديها7 MHC هاي سطحي سلولهاي اندوتليال و مويرگهاي گلومرولي گرافت هستند(Nankivell et al, 2010).
رد حاد سلولي با تجمع سلولهاي تک هستهاي در فضاي ميان بافتي و التهاب شريانها و توبولها مشخص ميشود. اکثر سلولهاي تک هستهاي که در فضاي ميان بافتي در اطراف توبولها نفوذ ميکنند، سلولهاي T CD4+ و CD8 + هستند. رد حاد سلولي باعث يک افزايش ناگهاني در کراتينين سرم، احتباس مايعات و گاهي اوقات تب و حساسيت پيوند ميشود. با درمانهاي فعلي، بروز رد حاد حدود 5 تا 10 درصد در سال اول در بيماران کاهش مييابد (Cornell et al, 2008).

1-2-3- رد مزمن
در پيوندهاي داراي عروق که بيش از شش ماه باقي ماندهاند با تکثير سلولهاي عضلاني صاف، انسداد شرياني به آرامي گسترش مييابد و در نهايت موجب آسيب ايسکميک و رد پيوند ميشود. از ويژگيهاي اين نوع رد پيوند کاهش پيشرونده عملکرد کليوي، حمله به پارانشيم کليه توسط سلول هاي T و نفوذ مداوم مايعات ميان بافتي توسط سلول هاي T و ماکروفاژها است (Cornell et al, 2008). رد مزمن در بافتهاي مختلف شواهد فيزيولوژيکي گوناگوني را نشان ميدهد.
1-3- پيشگيري از رد آلوگرافت
استراتژيهايي جهت جلوگيري از رد پيوند، بهبود بخشيدن به عمکرد آن و بالا بردن کيفيت زندگي گيرنده پيوند شامل سرکوب سيستم ايمني، القاء تحمل اختصاصيدهنده، سنجش سازگاري8 HLA، رديابي وجود آنتيباديهاي توليد شده از پيش، سازگاري متقاطع9 و تعيين گروه خوني ABO امروزه به کار برده ميشوند.
سرکوب سيستم ايمني را ميتوان با تخليه، انحراف ترافيک و مسدود کردن مسير پاسخ لنفوسيتها اعمال کرد. داروهاي سرکوبگر سيستم ايمني شامل داروهاي کوچک ملکول، داروهاي کاهنده و غيرکاهنده پروتئيني، داروهاي ترکيب شونده با پروتئينها، گلوبولينهاي ايمني داخل وريدي و گلکوکورتکوييدها هستند. اين داروها سه اثر عمده شامل اثر درماني (سرکوب رد)، پيامدهاي ناخواسته از نقص ايمني (افزايش عفونت و يا سرطان)?? و سميت غيرايمني در بافتهاي ديگر را دارند ( Halloran, 2004). داروهاي سرکوبگر سيستم ايمني که عمل آنها مهار يا نابود کردن لنفوسيتهاي T است، به عنوان رژيم درماني اصلي براي رد پيوند استفاده ميشوند (Abbas et al, 2011).
در حال حاضر مهمترين داروهاي باليني سرکوبکننده ايمني، مهارکنندههاي کلسينورين شامل سايکلوسپورين و FK-506 (تاکروليموس) هستندکه نسخه برداري برخي ژنها در لنفوسيتهاي T را مهار ميکنند. مايکوفنولاتمفتيل، آزاتيوپرين و راپامايسين نيز از ساير داروهاي مهم سرکوبگر سيستم ايمني هستند. خوشبختانه در سالهاي اخير شيوع عفونت و سرطان ناشي از مصرف داروهاي سرکوب کننده سيستم ايمني کاهش يافته است که شايد به دليل جلوگيري از رد پيوند با استفاده از مديريتهاي پيش از عمل باشد (Halloran, 2004).
در پيوند اعضا با هدف تطابق بيشتر بين دو فرد دهنده و گيرنده گرافت، سعي بر آن است که از تعداد موارد تفاوت در آللهاي HLA بارز شده بر سطح سلولها کاسته شود. به طور معمول آزمايش HLA تنها در مورد HLA-A، HLA-B و HLA-DR صورت ميگيرد براي تعيين هاپلوتايپهاي HLA از دو روش سرولوژيک و ملکولي استفاده ميشود. اساس روش سرولوژيک استفاده از سرم افرادي که از قبل در معرض HLAهاي متفاوت قرار داشتهاند، به عنوان سرم استاندارد است و اساس روش ملکولي استفاده از تکنيک10 PCR است (Mahdi, 2013).
بررسي تطابق گروههاي خوني ABO در گيرنده و دهنده پيوند ضروري و متداول است. در صورت وجود ناسازگاري در اين زمينه هيچ شانسي براي بقاء پيوند وجود ندارد. در صورت عدم تطابق جزئي گروههاي خوني از روشهاي گوناگوني از جمله اندازهگيري ميزان آنتيبادي، کاستن از ميزان سلولهاي B فعال و کاستن از ميزان آنتيبادي سرمي استفاده ميشود (Muramatsu et al, 2014).
گيرندگان پيوند از نظر وجود آنتيباديهايي که از قبل به دلايل متفاوت از جمله انتقال خون، پيوندهاي پيشين و بارداري در بدن آنها وجود دارند، غربال ميشوند. استفاده از روشهاي سيتوتوکسيک، فلوسايتومتري و سرولوژيک در اين غربالگري معمول است که در تشخيص رد فوق حاد و حاد عروقي کاربرد دارند (Abbas et al, 2011). چنانچه آزمايشها بر عليه سرم افراد گوناگون انجام شود، رديابي وجود آنتيبادي توليد شده از پيش و چنانچه بر عليه سرم اهداکننده خاص انجام شده باشد، سازگاري متقاطع گفته ميشود (Qureshi, 1997).
ساير عوامل دخيل در رد پيوند شامل سن، جنس، نژاد، اعتياد و سابقه بيماريهاي پيشين در گيرنده و دهنده پيوند، توده بدني و سابقه رد پيوند فرد گيرنده، زنده يا جسد بودن فرد اهداکننده پيوند و غيره است. مطالعات پيشين به خصوص در مورد پيوند کليه حاکي از آناند که بهترين بازه سني براي اهدا کنندگان بين بيست تا چهل سال و براي دريافت کنندگان بين چهل تا شصت سال است. احتمال رد پيوند در گيرندگان بالاي هفتاد سال افزايش مييابد (Almasi Hashiani et al, 2011).
بر اساس مشاهدات، نژاد سفيد پوست در مقايسه با آمريکاييهاي آفريقايي تبار شانس بقاء پيوند بالاتري را نشان ميدهند. از نظر جنسيت نيز موفقيت پيوند کليه در مردان بالاتر است. پيوند از فرد زنده به خصوص خويشاوند نسبت به فرد مرگ مغزي نتايج بهتري را نشان ميدهد.
چنانچه گيرنده آلوگرافت کليه دچار ديابت، بيماريهاي قلبي و عروقي به خصوص تصلب شرايين، سندرم گودپاسچر، هپاتيت و بيماريهاي رواني باشد، فقط در صورت درمان، عمل پيوند انجام ميگيرد. وجود HIV11 در فرد اهداکننده و گيرنده از موارد منع پيوند محسوب ميشود. در صورتي که فرد گيرنده سابقه رد پيوند را در کارنامه خود داشته باشد، عمل پيوند با دقت بيشتري انجام ميشود.

1-4-استرس اکسيداتيو
گونههاي فعال اکسيژني (ROS12) از جمله سوپراکسيدها، هيدروژن پراکسيدها و راديکالهاي هيدروکسيل به طور طبيعي در تمام ارگانيسمهاي هوازي توليد شده و در تعادل با آنتياکسيدانها قرار دارند. استرس اکسيداتيو زماني اتفاق ميافتد که اين توازن حياتي به دليل کاهش آنتياکسيدانها، افزايش ROSها و يا هر دو برهم خورد (Scandalios, 2002).
استرس اکسيداتيو در پاتوژنز بسياري از بيماريها از جمله تصلب شرايين، فشار خون بالا، ديابت، بيماريهاي ايسکميک، و سرطان نقش دارد. به دليل حمله راديکالهاي آزاد اکسيژن به مولکولهاي زيستي مانند چربيها، پروتئينها و DNA استرس اکسيداتيو خطرناک محسوب ميشود (Yoshikawa et al, 2002). در اين شرايط تمامي ارگانيسمها با بالا بردن القاء توليد آنزيمهاي آنتياکسيدان دفاعي سعي بر سازگاري با شرايط و برقراري دوباره توازن را خواهند داشت (Scandalios, 2002). براي حفظ تعادل و جلوگيري از خطرات ناشي از ROSها، سلولها از دو مسير دفاعي آنزيمي و غيرآنزيمي استفاده ميکنند. مسير غيرآنزيمي با استفاده از ويتامينهاي C و E، گلوتاتيون، يوريکاسيد، يوبيکوئينن، ليپوئيکاسيد و کاروتينوئيدها و مسير آنزيمي با عمل سوپراکسيددسموتازها، گلوتاتيون پراکسيدازها، کوئينوناکسيدوردوکتازها، کاتالاز، ميلوپراکسيداز و غيره عمل ميکنند.

1-5-گلوتاتيون پراکسيداز 1 (GPX1)
گلوتاتيون پراکسيدازها خانوادهاي آنزيمي با فعاليت پراکسيدازي هستند که نقش اصلي آنها محافظت ارگانيسمها در برابر استرسهاي اکسيداتيو است. اين خانواده داراي هشت ايزومر است که به ترتيب با اعداد يک تا هشت نامگذاري ميشوند (GPX1-8). ژن گلوتاتيون پراکسيداز يک انساني (hGPX1) يکي از اعضاي اين خانواده است. اين ژن در موقعيت کروموزومي3p21.31 قرار گرفته و طول آن kb 424/1 (49394609 – 49396033) است. از روي اين ژن دو ايزوفرم mRNA متفاوت کد ميشوند ( nextprot association nom: NX_ P07203) ( et al, 2000 Ratnasinghe ). ايزوفرم يک داراي يک اينترون و دو اگزون است که چند شکلي مورد مطالعه بر روي اگزون دوم آن قرار دارد.
ژن گلوتاتيون پراکسيداز1 يکي از مهمترين آنزيمهاي آنتياکسيدان درون سلولي را کد ميکند که در سيتوزول، ميتوکندري و بعضا پروکسيزوم يافت ميشود. عملکرد اين آنزيم سمزدايي پراکسيد هيدروژن و کاهش اثرات مضر آن در بدن است. آنزيم GPX1 در بسياري از شرايط فيزيولوژيک از کاتالاز موثرتر عمل ميکند. اين پروتئين از معدود پروتئينهاي مهرهداران عالي است که حاوي سلنيوم به فرم سلنيوسيستئين در جايگاه فعال خود است ( Lubos et al, 2011وRatnasinghe et al, 2000 ).
واکنش اصلي کاتاليز شده توسط گلوتاتيونپراکسيداز به شکل زير است:
2GSH + H2O2 ? GS-SG + 2H2O
در اين واکنش با تبديل دو گلوتاتيون احياء به گلوتاتيون ديسولفيد با واسطه گلوتاتيونپراکسيداز، H2O2 سمزدايي ميشود. سلنيوم حاضر در جايگاه فعال آنزيم در ابتدا در واکنش با پراکسيدهيدروژن اکسيد شده، سپس آنزيم با گلوتاتيون اول وارد واکنش ميشود و يک ملکول آب و GS-SER توليد ميکند. در نهايت با ورود گلوتاتيون دوم GS-GS تشکيل شده و آنزيم بازيافت ميشود.
RSeH + H2O2 ? RSeOH + H2O
RSeOH + GSH ? GS-SeR + H2O
GS-SeR + GSH ? GS-SG + RSeH
گلوتاتيون اکسيد شده سرانجام توسط واکنش زير و با فعاليت آنزيم گلوتاتيون ردوکتاز احيا ميشود:
GS-SG + NADPH + H+ ? 2 GSH + NADP+

فعاليت آنزيمي گلوتاتيون پراکسيداز يک تحت تاثير جايگزيني نوکلئوتيد T به جاي نوکلئوتيد C در موقعيت کدون 198 (rs1050450) اين ژن کاهش مييابد. در اين چند شکلي اسيد آمينه لوسين جايگزين پرولين ميشود (Lubos et al, 2011). مطالعات بسياري رابطه اين چند شکلي با احتمال ابتلا به انواع مختلفي از بيماريها را نشان ميدهند (Ratnasinghe et al, 2000 و et al, 1988 Nève).

شکل 1-1- ساختار ژنتيکي گلوتاتيونپراکسيداز يک و چند شکلي ژنتيکي GPX1pro198leu

1-6- سوپراکسيددسموتاز1 (SOD1)
سوپراکسيددسموتاز خانوادهاي آنزيمي است که به عنوان اولين و مهمترين سد دفاع آنتياکسيداني در برابر ROSها شناخته ميشود. تا کنون سه ايزوفرم از اين آنزيم در پستانداران شناسايي شده است، SOD1 يا Cu/Zn-SOD13 ، SOD2 يا 14 Mn-SOD و 15SOD3 يا EC-SOD. SOD1 برخلاف SOD2 و SOD3 دايمر است و در سيتوپلاسم فعاليت ميکند (Kim C H, 2013). ژن سوپراکسيد دسموتاز يک يا کوپر/ زينک سوپراکسيد دسموتاز با طول kb 309/9 ( 31668930 – 31659621) داراي پنج اگزون و چهار اينترون است که در موقعيت کروموزومي 21q22.11 قرار گرفتهاست (genetic home reference/gene/SOD1) (Kase et al, 2012).
آنزيم کوپر/زينک سوپراکسيد دسموتاز يک آنزيم عمدتا سيتوزولي است که مسئول سمزدايي گونههاي فعال اکسيژن طبق واکنش زير است:
M(n+1)+-SOD + O2? ? Mn+-SOD + O2
Mn+-SOD + O2? + 2H+ ? M(n+1)+-SOD + H2O2

اين آنزيم که حاوي مس و روي است که در فرم اکسيد شدهي خود با يک يون سوپراکسيد واکنش داده و اکسيژن توليد ميکند. سپس فرم احيا ايجاد شده با سوپراکسيد دوم وارد واکنش شده و هيدروژن پراکسيد توليد ميکند. پس از آن آنزيم دوباره بازيافت شده و به فرم اکسيد درميآيد. در اين واکنش M ميتواند نيکل، آهن، منگنز يا مس باشد.
در صورت ايجاد جهش در ساختار اين ژن و يا عدم تا شدن صحيح پروتئين آن، در مسير سمزدايي اختلال ايجاد ميشود. در همين راستا جايگزيني نوکلئوتيد حاوي گوانين در جايگاه 251 (rs2070424) در اينترون سه اين ژن به جاي نوکلئوتيد حاوي آدنين ميتواند احتمال ابتلا به برخي بيماريها را افزايش دهد Zhang et al, 2011) و et al, 2009 Seetharaman).
rs2070424

شکل 1-2- ساختار ژنتيکي سوپراکسيد دسموتاز يک و چندشکلي SOD1 A251G
1-7- هدف
استرس اکسيداتيو فرآيندي است که با افزايش در گونههاي فعال اکسيژني و يا کاهش فعاليت آنتياکسيدانها شناخته ميشود. تجمع گونههاي فعال اکسيژني (ROS) نقش مهمي در ايجاد بسياري از بيماريها از جمله انواع سرطان، ديابت، آلزايمر، بيماريهاي قلبي (16CVD)، بيماري مزمن کليوي 17(CKD) و ALS18 ايفا ميکند. آنزيمهاي گلوتاتيون پراکسيداز و سوپراکسيد دسموتاز از جمله آنزيمهايي هستند که در جهت سمزدايي و غير فعالکردن اين ترکيبات عمل ميکنند (Crawford et al, 2011، Crawford et al, 2012 وKase et al, 2012). در اين مطالعه بر آن شديم تا ارتباط چند شکليهاي pro198leu ژن گلوتاتيون پر اکسيداز يک و A251G ژن سوپراکسيد دسموتاز يک با خطر رد حاد در بيماران دريافت کننده پيوند کليه را مورد بررسي قرار دهيم.

1-8- فرضيه
ژن GPX1 pro198leu:
ژنوتيپهاي TT و TC نسبت به ژنوتيپ CC در چند شکلي GPX1 pro198leu خطر رد حاد پيوند کليه را افزايش ميدهند.
با افزايش آلل T در چند شکلي GPX1 pro198leu خطر رد حاد پيوند کليه افزايش مييابد.
ژن SOD1 A251G:
ژنوتيپهاي GG و AG نسبت به ژتوتيپ AA در چند شکلي SOD1 A251G خطر رد حاد پيوند کليه را افزايش ميدهند.
با افزايش آلل G در چند شکلي SOD1 A251G خطر رد حاد پيوند کليه افزايش مييابد.

فصل دوم

مروري بر تحقيقات انجام شده

2-1- مطالعات انجام شده بر روي چند شکلي GPX1 pro198leu و ارتباط آن با بيماريهاي گوناگون
در مطالعهاي که توسط Ye و همکارانش در سال 2013 انجام شد، رابطه دوازده چند شکلي ژنهاي متفاوت از جمله GPX1 pro198leu با بيماريهاي کرونري قلب مورد بررسي قرار گرفت. نتايج اين متاآناليز ارتباط چند شکليC/T GPX1با استعداد ابتلا به بيماري عروق کرونري قلب (CHD)19 در جمعيت چين و هند را با OR برابر 61/1 براي آلل T تاييد ميکند (Ye et al, 2013).
پژوهشي در سال 2013 توسط Huang و همکارانش در تبت بر روي ارتباط چندشکليهاي متفاوت از ژنهاي سلنوپروتئين با20 KBD و غلظت سرمي سلنيوم/يد انجام شد. نتايج نشان ميدهند که هاپلوتايپهاي TCC، TTC، TTT از سه چندشکلي GPX1 با rs1050450، rs1800668 و rs3811699 ارتباط معناداري با KBD دارند. علاوه بر اين، چندشکلي ژنGPX1 (rs1050450) ممکن است به طور قابل توجهي با غلظت يد در تبتيها ارتباط داشته باشد (Huang et al, 2013).
Hong و همکارانش در سال 2013، چندشکلي ژن GPX1 (rs1050450) و احتمال خطر ابتلا به سرطان را در متاآناليزي مورد بررسي قرار دادند. نتايج اين مطالعه ارتباط قابل توجهي از چندشکلي مورد بررسي در اين ژن با خطر ابتلا به سرطان را نشان نميدهد (Hong et al, 2013).
در سال 2014 مطالعهاي توسط Oskinaو همکارانش در ناحيه سيبري روسيه بر روي چندشکليGPX1 pro198leu و ارتباط آن با سرطان پروستات صورت گرفت. در اين مطالعه ارتباط معناداري مشاهده نشد (Osakina et al, 2014).
متاآناليزي به کوشش Zhang و همکارانش در سال 2014 در مورد ارتباط چند شکلي GPX1 pro198leu با بيماريهاي قلبي و عروقي به چاپ رسيد. در اين مطالعه افزايش قابل توجه خطر ابتلا به CVD با OR مساوي 84/1 در حضور لوسين در اين جايگاه ديده شد (Zhang et al, 2014).

2-2- مطالعات انجام شده بر روي چند شکلي SOD1 A251G و ارتباط آن با بيماريهاي گوناگون
در سال 2006 Oestergaard و همکارانش احتمال ابتلا به سرطان سينه را با 25 چندشکلي از 10 ژن از اعضا سيستم دفاع آنتياکسيداني در جمعيت انگلستان مورد بررسي قرار دادند. در اين مطالعه ارتباط معناداري بين چند شکلي SOD1 A251G و سرطان سينه مشاهده نشد (Oestergaard et al, 2006).
پژوهشي در سال 2008 توسط Rajaraman و همکارانش بر روي چند شکليهاي ژنتيکي ژنهاي مرتبط با استرسهاي اکسيداتيو (CAT, GPX1, NOS3, PON1, SOD1, SOD2 & SOD3) و ايجاد تومور مغزي در بزگسالان انجام شد. در اين پژوهش رابطه معناداري بين چند شکليهاي SOD1 A251G و GPX1 pro198leu و ابتلا به تومور مغزي در بزرگسالان مشاهده نشد (Rajaraman et al, 2008).
در سال 2010 مطالعهاي توسط Liu و همکارانش بر روي ارتباط چندشکليهاي ژن SOD1 و از دست دادن شنوايي ناشي از صدا در کارگران چيني انجام شد. نتايج اين مطالعه اثر حفاظتي ژنوتيپ AA را با 45/0OR= نشان ميدهد (Liu et al, 2010).
مطالعهاي در سال 2011 بر روي چند شکليهاي متفاوت ژن SOD1 و خطر ابتلا به NIHL21 در جمعيت هان توسط Li و همکارانش انجام شد. در اين پژوهش الل G از چند شکلي A251G اين ژن احتمال ابتلا به NIHL را افزايش ميدهد (67/0OR=) (Li et al, 2011).
در سال 2011 مطالعهاي بر روي چند شکليهاي 251A/G ژن سوپر اکسيد دسموتاز، 21A/T- ژن کاتالاز و pro198leu ژن گلوتاتيون پراکسيداز و ارتباط آنها با آب مرواريد وابسته به سن، توسط Zhang و همکارانش انجام شد. نتايج نشان ميدهند که هيچ تفاوت قابل توجهي در بيماران نسبت به گروه کنترل براي چند شکلي GPX1 pro198leu وجود ندارد. اين در حالي است که ژنوتيپ GG در چند شکلي SOD1 A251G باعث افزايش خطر ابتلا به آب مرواريد وابسته به سن با OR مساوي 64/1 ميشود (Zhang et al, 2011).
مطالعه ديگري توسط Kase و همکارانش در سال 2012 بر روي چند شکلي A251G ژن SOD1 و اثر آن بر nonsyndromic myelomeningocele صورت گرفت. نتايج اين پژوهش نشان دهنده اثر حفاظتي الل G با OR برابر 66/0 بر روي استعداد ابتلا به اين بيماري است (Kase et al, 2012).
در سال 2012 Zeng و همکارانش مطالعهاي بر روي ارتباط ميان چندشکلي SOD1 A251G و NIHLدر دو گروه ( به ترتيب در معرض 92-85 و بيش از 82 دسيبل) انجام دادند. نتيجه اين مطالعه نشان دهنده اثر محافظتي ژنوتيپ AA به ترتيب با OR، 37/0 و 25/0 در اين دو گروه است (Zeng et al, 2012).

2-3- مطالعات انجام شده بر روي رد حاد پيوند کليه
پژوهشي در سال 2013 توسط Kim و همکارانش بر روي ارتباط چندشکلي TGFBR2 Asn389Asn (rs2228048) و رد حاد پيوند کليه در کره انجام شد. در اين مطالعه ارتباط معناداري بين اين چند شکلي و افزايش ريسک رد حاد پيوند کليه مشاهده شد(026/0 p=) (Kim et al, 2013).
در سال 2013 مطالعهاي توسط Misra و همکارانش بر روي ارتباط رد حاد پيوند کليه و ESRD با حذف و اضافه چهارده جفت باز در پروموتر ژن HLA-G صورت گرفت. در اين مطالعه ارتباطي معنادار بين اين چند شکلي و رد حاد پيوند کليه و ابتلا به ESRD مشاهده شد به طوري که در بيماران فاقد رد حاد پيوند نسبت به افراد داراي رد حاد سطح بالاتري از HLA-G محلول ديده ميشود (Misra et al, 2013).
مطالعهاي توسط Mandegary و همکارانش بر روي اثر ژنوتيپ ژنهاي TNF-?22 و IL-1023 فرد اهدا کننده با عملکرد تاخيري گرافت24 و رد حاد پيوند کليه در سال 2013 صورت گرفت. در اين مطالعه ميان آلل A از چندشکلي TNF -308G>A با OR برابر 1/3 و DGF ارتباط معناداري مشاهده شد. نتايج نشان داد که اهدا کنندگان با توليد TNF بالا ممکن است خطر DGF در دريافت کنندگان را افزايش دهند (Mandegary et al, 2013).
پژوهشي توسط نکويي و همکارانش در سال 2013 در شيراز بر روي چندشکلي ژنتيکي GSTO2 (N142D) و خطر رد حاد پيوند کليه انجام شد. در اين مطالعه ارتباط معناداري ميان اين چندشکلي با ESRD و رد حاد پيوند کليه مشاهده نشد. با اين حال طبق نتايج اين مطالعه، ژنوتيپ DD در بيماراني که پيوند از اهداکننده جسد بر روي آنها صورت گرفته بود با 82/3OR= احتمال رد حاد پيوند کليه را افزايش ميدهد (Nekooie-Marnany et al, 2013).
Pawlik و همکارانش در سال 2014 مطالعهاي براي يافتن ارتباط رد حاد پيوند کليه و چندشکلي ژنتيکي IVS3 +17T/C CD28 انجام دادند. اين مطالعه ارتباط معناداري بين چندشکلي IVS3 +17T/C در ژن CD28 و رد حاد پيوند کليه را نشان داد، به طوري که OR، CC+CT در مقابل TT برابر 93/1 بود (Pawlik et al, 2014).
در سال 2014 Chen و همکارانش پژوهشي در زمينه ارتباط رد حاد پيوند کليه و چند شکليهاي ژنتيکي در ژنهاي IL-2، IL-10، IL-2RB و TGF-?1 انجام دادند. ميان اين چند شکليها و خطر رد حاد پيوند کليه ارتباط معناداري مشاهده نشد (Chen et al, 2014).

فصل سوم

مواد و روش انجام کار

3-1-نمونه گيري
اين مطالعه بر روي 262 بيمار پيوند کليه از مرکز پيوند اعضا بيمارستان نمازي شيراز در سالهاي 1390، 1391 و 1392 انجام شد. تمامي نمونهها به صورت خون کامل جمعآوري شده و در تيوبهاي حاوي EDTA در شرايط دمايي چهار درجه سانتيگراد به آزمايشگاه انتقال داده شدند. در اين طرح تعداد 262 نمونه کنترل از پايگاه انتقال خون شيراز جمع آوري و طبق شرايط گفته شد به آزمايشگاه منتقل گرديد. افراد سالم از نظر ميانگين سني و فراواني جنسي با بيماران مطابقت داده شدند. رضايتنامه از بيماران و افراد سالم اخذ و انجام اين مطالعه توسط کميته اخلاق دانشگاه شيراز تاييد شدهاست. در اين پژوهش يک مطالعه مورد-شاهدي بين افراد سالم و بيماران پيوند کليه و يک مطالعه بين بيماران پيوندي دچار عارضه رد حاد و فاقد رد حاد انجام شد. رد حاد در طول 6 ماه اول پس از پيوند با انجام بيوپسي (نمونه برداري از بافت) تاييد ميشود (Finkelstein et al, 1976).

جدول3-1: مشخصات افراد مورد مطالعه
بيماران پيونديکنترلتعداد کل262262ميانگين سني2/14±3/426/13±9/42

3-2-وسايل مورد استفاده
وسايل استفاده شده در اين مطالعه عبارتند از:
* سمپلر (ساخت Brand, Socorex )
* ترازو
* Rotator (ساخت پديده نوژن پارس)
* ميکروسانتريفيوژ (ساخت Hettich)
* Vortex (ساخت Scientific industries INC)
* Spine down
* دستگاه PCR (ساخت Techne)
* انکوباتور
* تانک الکتروفورز و منبع تغذيه جريان الکتريکي (ساخت پايا پژوهش)
* دستگاه Gel Documentation (ساخت Uvitec Cambridge)
* اتوکلاو (ساخت ريحان طب)
* ماکروفر (ساخت بوتان)
3-3-مواد مورد استفاده
3-3-1: محلولهاي لازم جهت استخراج DNA
* محلول NH4Cl (170 ميليمولار)
* محلول NaCl-EDTA (10 ميليمولار)
* محلول NaOH (50 ميليمولار)
* محلول Tris-HCl (1مولار)
3-3-2: مواد استفاده شده جهت انجام PCR
* بافر 10X (10X Buffer)
* MgCl2
* پرايمرهاي رفت و برگشت براي ژنهاي GPX1 و SOD1
* dNTP
* Taq Polymerase
همگي ساخت سينا ژن
3-3-3: مواد استفاده شده جهت انجام الکتروفورز
* بافر TBE (X 5/0)
* Agarose (ساخت Invitrogen)
* 6X Loading Buffer (سينا ژن)
* محلول اتيديم برمايد (X 1000)
* DNA Ladder 100bp (Vivantis)
* Boric acid (Merck)
* Tris base (Merck)
* EDTA (Merck)
3-3-4: مواد استفاده شده جهت اثر دادن آنزيم محدود کننده
* آنزيمهاي محدود کننده ApaI و MspI (ساخت Fermantas )
* B Buffer براي آنزيم ApaI
* Tango Buffer براي آنزيم MspI
3-4- استخراج DNA به روش جوشاندن (Boiling)
3-4-1: ساخت محلولهاي مورد نياز جهت استخراج
* براي ساخت محلول NH4Cl(170 ميليمولار) 1/0گرم NH4Cl را در 10 سيسي آب استريل حل شده و



قیمت: تومان


پاسخ دهید